細胞狀態(tài)很差，常常出現的現象是：細胞邊緣不清晰、細胞不飽滿(mǎn)、折光性差、背景比較臟、黑點(diǎn)很多、細胞碎片多（細胞凋亡后的細胞碎片）、單個(gè)細胞內有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細胞出現老化，也就是細胞比較扁平、增殖減緩、細胞核體積增大、細胞突觸變多，此時(shí)觀(guān)察到的細胞狀態(tài)也是不正常的。

▲ 圖1：背景很臟；

▲圖2：有較多小黑點(diǎn)

因此細胞狀態(tài)差只是對這些現象的一種籠統說(shuō)法。

究其根本，細胞狀態(tài)變差主要是由于兩種原因：

1 細胞營(yíng)養條件不夠

2 細胞被污染了

今天我們將深入分析影響細胞狀態(tài)的這些原因。

一、營(yíng)養條件不夠

細胞營(yíng)養條件不夠時(shí)，就需要從培養基方面考慮。

（1）血清

由于血清來(lái)源于動(dòng)物，且含有細胞培養中所需的各種營(yíng)養（血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(cháng)因子、激素、無(wú)機物等），這奠定了血清是細胞培養實(shí)驗中最基礎普遍的試劑的基礎。

市面上的牛血清產(chǎn)品名稱(chēng)雖然五花八門(mén)，但根據其不同的特性，追其根本，大致可分為以下四種。根據牛的取血年齡可以區分：

胎牛血清（Foetal Bovine Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心臟穿刺采血得來(lái)的血清。

國產(chǎn)胎牛血清（并無(wú)明確定義，但通常用此命名）指的是出生4-6小時(shí)，且未進(jìn)行哺乳（unsuckled）進(jìn)食的新生牛，有時(shí)還稱(chēng)作國產(chǎn)新生牛血清。 

新生牛血清（Newborn Calf Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)NBCS，或稱(chēng)小牛血清）指的是出生14天-3個(gè)月進(jìn)行取血的牛血清。

成年牛血清（Adult Bovine Serum，簡(jiǎn)稱(chēng)ABS）指的是取血時(shí)牛齡通常超過(guò)12個(gè)月的牛血清。

以上取血牛齡的差異主要是受當地國家畜牧業(yè)的發(fā)展及法規限制影響，因為牛血多為畜牧業(yè)副產(chǎn)業(yè)，并未有專(zhuān)門(mén)為取血而養的牛。

這幾種不同牛齡血清所含的促細胞生長(cháng)因子、促貼附因子、激素及其他活性物質(zhì)等組分與比例不同。常規來(lái)說(shuō)，牛齡越小的牛血清，細胞培養效果越好。但是也需要根據自己培養的細胞類(lèi)型來(lái)選擇最合適的血清。

同一血清不同批號內的成分和營(yíng)養組成比例會(huì )不同，因為血清來(lái)源于動(dòng)物，其組成成分有1000種左右，且血清組成及含量常隨供血動(dòng)物的性別、年齡、生理條件和營(yíng)養條件不同而異。每個(gè)批號的組分和百分比含量都是不固定的，所以批間差異是存在的。因此在實(shí)驗過(guò)程中，需要經(jīng)過(guò)測試來(lái)找尋合適的血清批次。當實(shí)驗需要更換血清時(shí)，細胞需要有一段適應期。因此，要根據自己的細胞種類(lèi)進(jìn)行合適的選擇。

（2）基礎培養基

培養細胞時(shí)，除了血清還需要添加基礎培養基，混合成為*培養基，基礎培養基是成分確定且知其確切含量的，可以補充血清中缺乏的營(yíng)養元素，基礎培養基一般含有氨基酸、無(wú)機鹽、維生素、含碳物質(zhì)，蛋白和其他營(yíng)養元素，每種成分對于細胞存活、代謝等功能都有不同影響，不同細胞系需要的成分含量也不同，因此市面上會(huì )存在各類(lèi)培養基配方，如DMEM，RPMI-1640，M-199，MEM等，基礎培養基也需要根據自己培養的細胞種類(lèi)進(jìn)行更合適的選擇。自行配制基礎培養基時(shí)，需要注意是否需另外添加營(yíng)養物或必需物至培養基中（如：碳酸氫鈉）并調整pH值。使用不適合的培養基培養細胞，細胞仍可生長(cháng)但特性會(huì )改變。培養基中常用的酚紅（pH指示劑）本身有微弱雌激素作用，會(huì )刺激具有雌激素受器的細胞生長(cháng)。

如果您都是按照操規范保存培養基和培養細胞，那么我們繼續考慮污染情況。

二、細胞被污染

污染情況通常從以下幾部分考慮。

通常微生物污染也叫做外源污染，如：真菌、酵母菌、細菌、支原體、黑膠蟲(chóng)、病毒、細胞交叉污染等。

這些污染都是有其自有特征的噢~

（1）真菌污染

這類(lèi)微生物外觀(guān)類(lèi)似棉絮狀的漂浮物，在顯微鏡下可觀(guān)察到菌絲體，污染早期不會(huì )使培養基變黃。

（2）酵母菌污染

顯微鏡下常見(jiàn)成串的珠狀物形態(tài)呈卵形，大約比細胞小5~10倍，當其進(jìn)行出芽生殖時(shí)，會(huì )聚集成連體結構；爆發(fā)污染嚴重時(shí)，會(huì )造成培養基pH值改變，不易除去。

（3）細菌污染

培養基在短時(shí)間內變成黃色或白色渾濁，細胞停止生長(cháng)甚至死亡；有些狀況下培養基顏色改變不明顯但細胞形態(tài)會(huì )變異（出現多角，多核狀況）、細胞不附著(zhù)，顯微鏡觀(guān)察背景有大量黑點(diǎn)。

（4）支原體污染

支原體種類(lèi)較多，常以寄生或腐生營(yíng)養方式生長(cháng)，廣泛存在于環(huán)境之中，是細胞培養過(guò)程常見(jiàn)污染，經(jīng)常來(lái)源于實(shí)驗人員（支原體常見(jiàn)于人體皮膚、呼吸道、生殖道和消化道）、動(dòng)物源血清及胰酶、消毒不*的器具，大小只有0.15~0.3μm，所以能通過(guò)一般標準的細胞培養過(guò)濾方法，0.22μm過(guò)濾膜。支原體增長(cháng)速度相較于細菌比較緩慢，污染初期（輕微）培養基可能依然清澈不會(huì )變黃，所以輕微污染時(shí)不容易用常規方法發(fā)現（細胞外觀(guān)觀(guān)察或是DNA染色法）確認。

▲ 左圖：感染前；                                                ▲ 右圖：感染后

支原體污染不但會(huì )緩慢改變細胞形態(tài)、增殖、基因表達、蛋白合成及代謝反應，它攜帶的DNA/RNA與蛋白更可能造成QPCR、Western Blot或外泌體實(shí)驗結果偏差。

（5）黑膠蟲(chóng)污染

目前科學(xué)界對黑膠蟲(chóng)并無(wú)定論，認為是不明沉淀現象或多種未知生物污染現象的通稱(chēng)。在高倍率顯微鏡頭下，可觀(guān)察到各式形狀的小黑點(diǎn)（卵圓狀、球狀、桿狀等）、活躍的布朗運動(dòng)及明顯游動(dòng)現象，部分黑膠蟲(chóng)具有細胞毒性，可引起細胞生長(cháng)遲緩或裂解凋亡。

▲ 黑膠蟲(chóng)污染

（6）病毒污染

病毒感染可能來(lái)自宿主動(dòng)物細胞或病人，病毒感染及傳播具有細胞專(zhuān)一性，在細胞培養污染物中是相對較難檢測的。然而一旦細胞遭受污染后顯微鏡下能明顯觀(guān)察到細胞碎片增多、腫大、圓縮、脫落等病態(tài)變形，嚴重時(shí)會(huì )在單層細胞上觀(guān)察到局部破損空斑。

▲ 左圖：Before infection；右圖：After 24 hours infectiond

（7）細胞交叉污染

曾有文獻報道統計，目前使用的細胞株大約有15~20%不是科學(xué)家們所認為的細胞，而在生物醫藥領(lǐng)域中，細胞來(lái)源和細胞株身份鑒定檢測觀(guān)念普遍缺乏。細胞株的交叉污染，常在不經(jīng)意的實(shí)驗疏失（不同細胞株分盤(pán)時(shí)，共享一瓶培養基、槍頭、移液管忘記更換，而造成不同細胞株之間的混合污染，或是實(shí)驗操作人員錄入錯誤細胞株名稱(chēng)，繼代時(shí)的培養皿，冷凍細胞時(shí)的凍存管）中發(fā)生，而造成錯誤后續數據搜集；目前大部分的科學(xué)期刊都已有“細胞相關(guān)實(shí)驗論文發(fā)表前，均需附上細胞鑒定報告”的規定（可查閱：文章發(fā)表前要求提供細胞鑒定的雜志），以此保證數據來(lái)源的正確性。

目前常用的細胞身份驗證的方式包括：短串聯(lián)重復序列（STR）、同功酶分析、染色體組分型、擴增片段長(cháng)度多態(tài)性（AFLP）的特征分析等方法。其中STR，是目前國際細胞庫（包括：ATCC、DSMZ或是JCRB）常用于細胞株身份鑒定方法。

三、細胞老化了

無(wú)論是原代細胞或是細胞株，在細胞培養過(guò)程中細胞老化現象是存在且常見(jiàn)的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細胞會(huì )出現特征包括：細胞增殖變慢、細胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細胞體積增大、細胞扁平、細胞質(zhì)中出現空泡等現象。

老化細胞不會(huì )立即死亡，但其基因表達會(huì )發(fā)生變化，如果細胞老化現象嚴重，建議從種子庫或工作庫重新復蘇細胞。

圖1： 實(shí)心箭頭指示的是發(fā)生細胞老化的HEK293細胞，SA-β-gal染色陽(yáng)性，而空心箭頭指的是未發(fā)生老化的細胞。

圖2： 被染上藍色的是發(fā)生老化的MSC細胞, 未被染色的是未發(fā)生老化的細胞。

由圖片可以看出老化細胞體積增大、細胞扁平。

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