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避免踩坑,注意別踩DNA測序里的大坑!
發(fā)布時(shí)間: 2021-08-27 點(diǎn)擊次數: 6646次DNA 測序技術(shù)自從發(fā)明以來(lái),作為一種重要的分子生物學(xué)手段,正在科研和臨床上得到了越來(lái)越廣泛的應用。下面,介紹一下DNA測序里的大坑。給大家一個(gè)前車(chē)之鑒吧。
坑一:信號衰減/中斷
測序信號衰減和中斷,是測序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題,原因多種多樣:模板中含有重復序列,模板中含有高級結構,模板中 GC 含量過(guò)高等,都會(huì )使得測序信號衰減和中斷。另外,引物的質(zhì)量不好,試劑失活了,都會(huì )造成這種問(wèn)題。解決的方法:反其道而行之,采用反向引物來(lái)進(jìn)行測序,然后通過(guò)序列拼接獲得全長(cháng)。有時(shí)候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧。這里,教大家一個(gè)小竅門(mén):在這個(gè)過(guò)程中,可以適量地加入 DMSO,并且進(jìn)行擴增。
坑二:重疊峰/亂峰
這個(gè)問(wèn)題一般是由于序列前面有連續的堿基,或者是引物的堿基缺失了。如下圖所示,模板中有單一位點(diǎn)的堿基缺失,堿基缺失導致測序結果移碼。
現在有很多測序公司,號稱(chēng)可以幫助設計引物;號稱(chēng)引物是 PAGE 級別的。這里,嚴重不推薦哈。最好還是自己動(dòng)手,豐衣足食。解決辦法:自己設計引物;自己合成引物;自己將引物進(jìn)行 PAGE 純化。反正就是掌握一個(gè)原則:自己動(dòng)手,豐衣足食。
坑三:Ploy 結構
有的時(shí)候,我們會(huì )遇到 Poly 結構,就是 G/C rich,G/C Cluster,Poly A,Poly T 結構等。這種結構的測序容易出現移碼現象,導致測序信號衰減和中斷(如下圖)。解決方法:還是反其道而行之。采用反向引物對模板進(jìn)行測序,測到該 poly 結構處,進(jìn)行拼接,不就可以獲得序列全長(cháng)嘛。
坑四:空載體
原因為:目的片段插入失敗,或者培養過(guò)程中目的片段丟失。解決方案:重起爐灶。重新挑選單克隆,進(jìn)行 PCR 后,再送去測序。
坑五:測序結果和文獻資料不一樣
這個(gè)會(huì )以為是實(shí)驗哪里出問(wèn)題了,或者是測序公司那里出問(wèn)題了。這個(gè)問(wèn)題是沒(méi)有辦法滴。同一種動(dòng)物,不同的種族,甚至不同的個(gè)體,基因序列都不一定*一樣。如果是 PCR 產(chǎn)物克隆測序,那還有 PCR 過(guò)程中的錯配因素等等。
一般比較正規的測序公司,提供的測序結果都是忠實(shí)結果,和文獻序列不一樣,也就只好不一樣啦。
坑六:重復序列
如下圖所示,好看吧?好看是好看,但是真的看到這個(gè)結果,可能就要哭鼻子了??赡艿脑颍簶悠分芯秃兄貜托蛄?,結果導致:測序結果和 Poly A/T 的結果一樣。這也會(huì )導致 Frame 滑動(dòng),結果出現移碼。
解決辦法: 還是反其道而行之,反向測序。有時(shí)能夠順利的通過(guò)重復序列區域,但是有時(shí)候又不一定能夠。全靠運氣吧。如果能夠的話(huà),通過(guò)多次的測序結果比對,還是做拼圖游戲吧,拼接可以得到全序列結果。
- 下一篇:一篇就夠了,帶你了解高通量測序!
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