DNA 測序技術(shù)自從發(fā)明以來(lái)，作為一種重要的分子生物學(xué)手段，正在科研和臨床上得到了越來(lái)越廣泛的應用。下面，介紹一下DNA測序里的大坑。給大家一個(gè)前車(chē)之鑒吧。

坑一：信號衰減/中斷

測序信號衰減和中斷，是測序過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題，原因多種多樣：模板中含有重復序列，模板中含有高級結構，模板中 GC 含量過(guò)高等，都會(huì )使得測序信號衰減和中斷。另外，引物的質(zhì)量不好，試劑失活了，都會(huì )造成這種問(wèn)題。解決的方法：反其道而行之，采用反向引物來(lái)進(jìn)行測序，然后通過(guò)序列拼接獲得全長(cháng)。有時(shí)候就象做拼圖游戲。大家 have fun 吧。這里，教大家一個(gè)小竅門(mén)：在這個(gè)過(guò)程中，可以適量地加入 DMSO，并且進(jìn)行擴增。

坑二：重疊峰/亂峰

這個(gè)問(wèn)題一般是由于序列前面有連續的堿基，或者是引物的堿基缺失了。如下圖所示，模板中有單一位點(diǎn)的堿基缺失，堿基缺失導致測序結果移碼。

現在有很多測序公司，號稱(chēng)可以幫助設計引物；號稱(chēng)引物是 PAGE 級別的。這里，嚴重不推薦哈。最好還是自己動(dòng)手，豐衣足食。解決辦法：自己設計引物；自己合成引物；自己將引物進(jìn)行 PAGE 純化。反正就是掌握一個(gè)原則：自己動(dòng)手，豐衣足食。

坑三：Ploy 結構

有的時(shí)候，我們會(huì )遇到 Poly 結構，就是 G/C rich，G/C Cluster，Poly A，Poly T 結構等。這種結構的測序容易出現移碼現象，導致測序信號衰減和中斷（如下圖）。解決方法：還是反其道而行之。采用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該 poly 結構處，進(jìn)行拼接，不就可以獲得序列全長(cháng)嘛。

坑四：空載體

原因為：目的片段插入失敗，或者培養過(guò)程中目的片段丟失。解決方案：重起爐灶。重新挑選單克隆，進(jìn)行 PCR 后，再送去測序。

坑五：測序結果和文獻資料不一樣

這個(gè)會(huì )以為是實(shí)驗哪里出問(wèn)題了，或者是測序公司那里出問(wèn)題了。這個(gè)問(wèn)題是沒(méi)有辦法滴。同一種動(dòng)物，不同的種族，甚至不同的個(gè)體，基因序列都不一定*一樣。如果是 PCR 產(chǎn)物克隆測序，那還有 PCR 過(guò)程中的錯配因素等等。

一般比較正規的測序公司，提供的測序結果都是忠實(shí)結果，和文獻序列不一樣，也就只好不一樣啦。

坑六：重復序列

如下圖所示，好看吧？好看是好看，但是真的看到這個(gè)結果，可能就要哭鼻子了?？赡艿脑颍簶悠分芯秃兄貜托蛄?，結果導致：測序結果和 Poly A/T 的結果一樣。這也會(huì )導致 Frame 滑動(dòng)，結果出現移碼。

解決辦法: 還是反其道而行之，反向測序。有時(shí)能夠順利的通過(guò)重復序列區域，但是有時(shí)候又不一定能夠。全靠運氣吧。如果能夠的話(huà)，通過(guò)多次的測序結果比對，還是做拼圖游戲吧，拼接可以得到全序列結果。