正規化管理的實(shí)驗室都會(huì )給新人進(jìn)行相關(guān)技能體系的培訓，但是被老板散養的研究僧或者無(wú)奈從 0 開(kāi)始做科研的臨床醫生也不在少數。他們在初始接觸分子實(shí)驗時(shí)，手持《現代分子生物學(xué)實(shí)驗指導》這本寶典，很容易被五花繚亂的實(shí)驗方法亂了陣腳······

連轉錄和反轉錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據自己的實(shí)際情況各取所需呢？首先，明確自己的定位，你目前要解決的是單個(gè)問(wèn)題而不是一口吃成一個(gè)大胖子，然后關(guān)鍵是明確實(shí)驗對象和實(shí)驗目的。 

舉個(gè)栗子，現在手頭上的樣本是某個(gè)類(lèi)型腫瘤臨床患者切除的組織，目的是檢測這些樣本與正常組織樣本中幾個(gè)“明星分子（如 P53 等與癌癥密切相關(guān)的分子）"是不是有差異表達，該怎么做？

1.明確自己最后一步實(shí)驗是什么 

根據實(shí)驗目的，最后一步的實(shí)驗其實(shí)已經(jīng)確定了，就是從分子層面比較不同樣本中幾個(gè)基因的表達，但是分子層面可以是 RNA 轉錄水平，也可以是蛋白質(zhì)表達水平。作為新人，自然選擇前者，因為經(jīng)打聽(tīng)和查資料后我發(fā)現，RNA 轉錄使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）方法就好，容易上手出結果快，而對比蛋白質(zhì)表達水平的 Western Blot（WB），在抗體成本和摸索實(shí)驗體系的時(shí)間成本上都不合算（當然，很多實(shí)驗中如果 RNA 轉錄水平出現差異，還是很有必要在蛋白水平進(jìn)行驗證的）。 

所謂 qPCR 技術(shù)，是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)實(shí)現了 PCR 從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。

2.找出所有涉及到的分子實(shí)驗 

從最后一步實(shí)驗往前推，qPCR 需要哪些基本的元素？具體如下： 

*qPCR 的模板→當然不能直接用腫瘤組織和正常組織→查資料發(fā)現模板是 cDNA→怎么制備 cDNA？→提取所有組織樣本的 RNA 進(jìn)行反轉錄（逆轉錄-聚合酶鏈式反應，RT-PCR）→我需要 RNA 抽提試劑盒和反轉錄試劑盒→完成 RNA 的提取和 cDNA 的合成（放心，試劑盒里都會(huì )有非常具體的操作說(shuō)明書(shū)，但是自己要多查資料了解原理，不然你和流水線(xiàn)操作員何異？） 

*qPCR 的引物→根據已經(jīng)確定的分子自己使用引物設計軟件設計或者查找文獻找到經(jīng)過(guò)驗證的引物，不要忘了 GAPDH 或者其他內參的引物 

*SYBR® GREEN→商業(yè)試劑盒 

*酶→包含在 SYBR® GREEN 試劑盒中 

*RNase-free H2O→一般在 SYBR® GREEN 中會(huì )有對應的 H2O，小伙伴們千萬(wàn)不要使用正常 PCR 中使用的高溫滅菌 H2O，否則溶解曲線(xiàn)讓你分分鐘想撞墻。

3.Just do it 

根據 SYBR® GREEN 試劑盒說(shuō)明書(shū)中的體系要求完成實(shí)驗操作（冰上操作）和對 qPCR 儀器的設置，具體儀器的使用方法一定要多多問(wèn)別人。