很多時(shí)候，我們千辛萬(wàn)苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結果。這實(shí)在是一件憾事。其實(shí)，免疫組化結果分析的 protocol 教科書(shū)和實(shí)驗手冊上面都有。今天主要談?wù)剳撟⒁獾囊恍┦马椇图记?，并且有獨門(mén)絕招獻上，都是干貨喲。

對照染色 

和做實(shí)驗的時(shí)候必須設立對照組一樣，免疫組化也必須設立對照染色。沒(méi)有對照染色的免疫組化結果是不可信的。對照一般有陽(yáng)性組織對照，陰性組織對照，陰性試劑對照，自身對照。一般來(lái)說(shuō)，有一個(gè)陽(yáng)性組織對照和一個(gè)陰性組織對照就足夠了。 

定位 

抗原表達必須在特定部位。如 LCA 應定位在細胞膜上；CK 應定位在細胞漿內；PCNA 及 p53 蛋白應定位在細胞核內等等。不在抗原所在部位的陽(yáng)性著(zhù)色，不能視為確切的陽(yáng)性結果。有可能是非特異性染色或者假陽(yáng)性。不能確定怎么辦？這就要用到上一段提到的對照染色了。

半定位 

現在一般用圖像分析系統進(jìn)行定量。如果你的實(shí)驗室不幸沒(méi)有那么高大上的話(huà)，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了。因為人為主觀(guān)性比較強，所以只能稱(chēng)作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級：弱（+），中（++），強（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強（+++）=3。至少隨機觀(guān)察 5-10 個(gè) HPF。然后根據（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計算出數值；總數值 <1.0 者為（+），1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)。

圖像分析儀 

如果要進(jìn)行精確定量的話(huà)，就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類(lèi)型很多。這里就不一一介紹了。其實(shí)最想推薦的是一款圖像分析軟件：Image J。這是 NIH 開(kāi)發(fā)的免費軟件。一般的免疫組化結果分析用它就綽綽有余了。網(wǎng)上可以免費下載。其界面非常簡(jiǎn)潔。

現在，根據一個(gè)實(shí)例來(lái)看看如何用 Image J 來(lái)進(jìn)行圖像分析。如我們有一張細胞的免疫熒光染色的照片。那么，如何用 Image J 來(lái)計數細胞的個(gè)數呢？

首先，要把彩色的圖像轉換成黑白圖像。步驟如下：Image→Type→16-bit。轉換成黑白圖像后，將要計數的部分用高亮標示出來(lái)。步驟如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖動(dòng)鼠標，直到所有的細胞被標示出來(lái)。有時(shí)候 2 個(gè)細胞靠得比較緊密，會(huì )被計數為 1 個(gè)細胞。這個(gè)時(shí)候可以采用 Image J 的水洗功能。步驟如下：Image→Binary→Watershed。這些是本來(lái)計數成一個(gè)的細胞，經(jīng)過(guò)水洗之后，更加精確地被計數成了 2 個(gè)細胞。

然后，就可以正式開(kāi)始分析了。步驟如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的結果之前，還有一些選項需要選擇。如果想要計數全部的細胞，那么 Size 項里面選擇“0-infinity"。 Circularity 的默認值為“0.00-1.00"。一般就取默認值。軟件自動(dòng)測量了每個(gè)細胞的大小。這里因為是二維圖像，所以就是每個(gè)細胞的面積。

免疫組化是個(gè)苦活，時(shí)間長(cháng)，步驟多，還要經(jīng)常接觸有毒致癌物質(zhì)。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的結果。以上介紹了一些心得體會(huì )。希望廣大的同學(xué)們都能做出自己想要的結果，早點(diǎn)發(fā)文章。