在分子生物學(xué)中，未知基因全長(cháng)序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當我們不清楚目的基因的完整序列時(shí)，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等等......

背景介紹

今天我們來(lái)一起了解一種可從低豐度轉錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時(shí)，就可以通過(guò)RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長(cháng)的技術(shù)，RACE具有簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的優(yōu)勢，因而得到較多的運用。

RACE是什么？

RACE全稱(chēng)為rapid amplification of cDNA end，即cDNA末端快速擴增技術(shù)，就是已知部分cDNA序列，基于mRNA逆轉錄和PCR技術(shù)獲得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物學(xué)技術(shù)。

RACE可以應用在哪些實(shí)驗方向？

構建cDNA文庫

lncRNA全長(cháng)克隆

獲得抗體可變區序列

miRNA靶基因序列驗證

已知基因一段序列，克隆旁側序列

獲得病毒基因組

......

RACE技術(shù)類(lèi)型及特點(diǎn)？

RACE技術(shù)有多種類(lèi)型，根據各個(gè)RACE技術(shù)原理的不同，適合于不同的RNA，快來(lái)跟著(zhù)小編一起來(lái)了解下吧~

經(jīng)典RACE

經(jīng)典RACE技術(shù)是在1988年由Frohman等[1]發(fā)明。經(jīng)典RACE技術(shù)包括5'RACE和3'RACE，分別克隆cDNA的5'端和3'端。

1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A結構的特點(diǎn)，使用5'端帶有接頭序列的oligo dT與之結合進(jìn)行逆轉錄，獲得cDNA；

2. 再利用根據已知序列設計的上游引物和與接頭序列互補配對的下游引物進(jìn)行PCR擴增，得到cDNA 3'末端擴增產(chǎn)物。

1. 經(jīng)典RACE技術(shù)中的5'RACE是利用根據已知序列設計的下游引物GSP作為逆轉錄引物，合成一鏈cDNA；

2. 末端脫氧核苷酸轉移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A；

3. 帶有接頭序列的Oligo dT引物與一鏈cDNA 3'末端的poly A結合，合成二鏈cDNA；

4. 再以第二鏈cDNA為模板，利用GSP和接頭引物作為上下游引物進(jìn)行PCR擴增，得到cDNA 5'末端擴增產(chǎn)物；

得到的5'末端產(chǎn)物和3’末端產(chǎn)物可以通過(guò)克隆連接到適當的載體上，進(jìn)行測序獲得末端序列。將測序得到的cDNA末端序列，與已知的中間序列進(jìn)行拼接，就可獲得cDNA全長(cháng)序列。

經(jīng)過(guò)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由經(jīng)典RACE又衍生出多種RACE技術(shù)，增加了RACE技術(shù)的適用廣泛性，我們再來(lái)一起了解下其他的RACE技術(shù)吧！

Cap-switching RACE

Cap-switching RACE針對mRNA發(fā)生斷裂的可能，進(jìn)行了技術(shù)優(yōu)化[2-4]。

1. Cap-switching RACE是以Oligo dT作為逆轉錄引物，逆轉錄獲得一鏈cDNA；

2. 當逆轉錄到mRNA的5'帽子結構時(shí)，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶（MMLV）會(huì )在新合成的cDNA的3'末端加上若干個(gè)胞嘧啶；

3. 接著(zhù)，使用5'端帶有接頭、3'端帶有poly G結構的接頭引物與cDNA 3'端的poly C互補配對，逆轉錄酶繼續以接頭為模板合成cDNA，完成接頭轉化，新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列；

4. 然后再利用接頭引物進(jìn)行PCR獲得RACE產(chǎn)物。

RLM-RACE

RLM-RACE技術(shù)的出現同樣也是為了擴增到完整mRNA的5'末端，避免mRNA斷裂帶來(lái)的影響。

1. 首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶（CAP），特異性地識別并切除斷裂mRNA 5'端暴露的磷酸基團；

2. 再向體系中加入煙草酸焦磷酸酶（TAP），切除mRNA 5'端完整的帽子結構，使mRNA 5'端暴露出一個(gè)磷酸基團；

3. 接著(zhù)加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團連接，而切除了磷酸基團的斷裂RNA則不能與接頭結合，這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA；

4. 最后再進(jìn)行RT-PCR。