轉染(transfection)是真核細胞主動(dòng)或被動(dòng)導入外源核酸片段（DNA或RNA）而獲得新的表型的過(guò)程。轉染后的細胞會(huì )產(chǎn)生重組蛋白，或者特異性的增強/抑制細胞中的基因表達。轉染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。一定時(shí)間后收集轉染處理后的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進(jìn)行驗證，蛋白水平，使用 western blot 檢測，簡(jiǎn)單，快速，準確。

轉染的類(lèi)型

根據導入的核酸存在于宿主細胞的時(shí)間長(cháng)短，可以分為瞬轉和穩轉。根據轉染方式可以分為化學(xué)方法，生物方法，物理方法。

瞬時(shí)轉染是指將構建好的質(zhì)?；蛘遱iRNA通過(guò)某種方式導入到哺乳動(dòng)物細胞內（常用的工具細胞 HEK293 細胞），該外源核酸片段不整合到細胞自身的基因組上。隨著(zhù)細胞的生長(cháng)分裂，外源基因會(huì )逐漸丟失，在細胞內能夠存在 3-4 天，無(wú)法隨著(zhù)細胞的分裂進(jìn)入到子代細胞中。在這一段時(shí)間內，外源基因在細胞內發(fā)生轉錄翻譯，得到少量的蛋白。根據使用的載體不同，收集目的基因/蛋白進(jìn)行檢測的時(shí)間不同，通常在轉染后48h，目的蛋白的表達水平最高。瞬時(shí)轉染的特點(diǎn)是短時(shí)間內進(jìn)行蛋白的小量制備，滿(mǎn)足后續的實(shí)驗要求。

穩定轉染是外源DNA整合到細胞基因組中，成為細胞基因組的一部分從而得以復制，隨著(zhù)細胞分裂，子代細胞也同樣表達外源基因，這就是穩定轉染細胞的標志。穩定轉染是建立在瞬時(shí)轉染的基礎上的，先對細胞進(jìn)行轉染，再對得到的細胞池進(jìn)行篩選，篩選標記是抗生素，熒光報告基團等，通常需要2-3周的篩選時(shí)間，由此形成穩定轉染的細胞系。穩定轉染的特點(diǎn)是能夠得到蛋白的大量、長(cháng)期生產(chǎn)，滿(mǎn)足后續的一系列體內體外的表型實(shí)驗。

轉染方式

考慮到轉染效率是影響細胞實(shí)驗的重要因素，因此選擇合適的轉染試劑和轉染方式很關(guān)鍵。下面我們介紹一下常見(jiàn)的轉染方式。

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來(lái)說(shuō)是不可透過(guò)的屏障，因此研究人員開(kāi)發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進(jìn)入胞內，大致分為三類(lèi)：

細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，對于也帶負電荷的核酸片段（DNA和RNA）來(lái)說(shuō)是不可透過(guò)的屏障，因此研究人員開(kāi)發(fā)了很多方法能使核酸穿透細胞膜進(jìn)入胞內，大致分為三類(lèi)：

轉染的影響因素：

轉染過(guò)程中許多因素會(huì )影響轉染效率：如細胞類(lèi)型；細胞密度；質(zhì)粒大小、質(zhì)粒純度；血清；轉染試劑等。轉染實(shí)驗中，以下幾個(gè)因素進(jìn)行調整和優(yōu)化：

1. 轉染前的細胞狀態(tài)和密度

轉染時(shí)細胞密度以 50-80%最佳，細胞密度過(guò)高會(huì )嚴重影響細胞狀態(tài)和轉染效率（周期進(jìn)程阻滯，凋亡增加等）。同時(shí)支原體污染會(huì )嚴重降低細胞的轉染效率，因此轉染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。

2. 轉染時(shí)的質(zhì)粒純度

如果提取的質(zhì)粒不純，如帶少量鹽離子，蛋白、代謝物污染等都會(huì )顯著(zhù)影響轉染復合物的有效形成；而含有內毒素的質(zhì)粒對細胞存在很大的毒性作用（一般用去內毒素的提取試劑盒）?？股匾话銓φ婧思毎麩o(wú)毒，但轉染過(guò)程中細胞通透性增加，會(huì )使抗生素進(jìn)入細胞，從而降低細胞活性，導致轉染效率降低。

3. 轉染后的篩選時(shí)間

轉染后篩選不能太早或太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷大，增殖較慢，太晚會(huì )被沒(méi)有外源基因轉入的細胞所淹沒(méi)，最終導致篩選不出陽(yáng)性克隆。一般要在轉染后48h之后開(kāi)始加抗生素篩選。

4. DNA 與轉染試劑的比例

許多轉染方法需要優(yōu)化 DNA 與轉染試劑的比例。不同細胞系轉染效率通常不同，不同轉染試劑轉染效率差別很大，通常需要根據轉染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行預實(shí)驗，選擇合適濃度的外源DNA或RNA，調整外源核酸片段和轉染試劑的比例。