實(shí)驗步驟：

免疫熒光實(shí)驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱(chēng)為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說(shuō)法是細胞爬片）是免疫熒光實(shí)驗的第一步，細胞片的質(zhì)量對實(shí)驗的成敗至關(guān)重要，原因很簡(jiǎn)單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片（Slides or Coverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節或小竅門(mén)，非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質(zhì)選擇適當的固定方法，合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實(shí)驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類(lèi)似的，最重要的區別在于免疫熒光實(shí)驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀(guān)察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗結果。

（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.

（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

（4） 封閉。使用封閉液對細胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.

（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

（一）細胞準備

用于免疫熒光實(shí)驗的細胞可以是直接生長(cháng)在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經(jīng)過(guò)離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養時(shí)直接放入coverslips讓細胞生長(cháng)在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗，以免后續的漂洗操作引起細胞脫落。少數實(shí)驗需要使用這類(lèi)細胞或者懸浮細胞進(jìn)行免疫熒光觀(guān)察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。