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    細胞培養技術(shù)

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-29  點(diǎn)擊次數: 1601次
    簡(jiǎn)介


    一.細胞培養的基本原理

    細胞培養是用酶消化法將組織碎塊分離成單個(gè)細胞,用培養基制成細胞懸液,在體外適宜條件下,使細胞生長(cháng)繁殖,并保留其一定的結構和功能特性。細胞培養與組織培養、器官培養主要不同點(diǎn)在于原始培養的對象不同。細胞培養使用的是單個(gè)細胞懸液,組織培養使用的是組織塊(0.5~1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米),而器官培養使用的是器官原基或器官的一部分或整個(gè)器官。在組織培養中,細胞自組織塊周?chē)瞥霾⑸L(cháng),細胞在生長(cháng)過(guò)程中總有移動(dòng)(運動(dòng))或其它變動(dòng),這樣就使被培養的組織難以長(cháng)期維持其原有的結構和功能。培養時(shí)間越長(cháng),發(fā)生變化的可能性越大,結果常使單一類(lèi)型的細胞保存下來(lái),最終成了細胞培養。在細胞培養中,細胞生命活動(dòng)和體內細胞一樣,仍然是相互依存的,呈現一定的組織特異性,所以組織培養和細胞培養實(shí)際上無(wú)嚴格區別。


    細胞培養技術(shù)是生命科學(xué)中常用的研究手段,該方法能排除神經(jīng)體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾,觀(guān)察某些因素或藥物對培養細胞的直接作用。通過(guò)實(shí)驗可獲得某一類(lèi)型細胞的純培養。如心肌組織中心肌細胞約占50%,非心肌細胞占50%;而經(jīng)純化分離的心肌細胞懸液中,心肌細胞可達95%以上,這樣,心肌細胞原代培養實(shí)驗基本不受其它細胞的干擾。在細胞培養實(shí)驗中能直接觀(guān)察到培養細胞生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程;用定時(shí)顯微攝影記錄可發(fā)現一些肉眼觀(guān)察不到的生命現象;還可利用電鏡手段、同位素標記、放免法和免疫組化法等來(lái)研究細胞形態(tài)結構及細胞內化學(xué)物質(zhì)的分布。此外,還能節約研究費用。如在某些研究中,用100只動(dòng)物做實(shí)驗所獲得結論與用100張蓋玻片或幾十個(gè)培養瓶而獲得結論具有相同的統計學(xué)意義,而細胞培養較之大批量的動(dòng)物飼養花費要小。


    但細胞培養方法也存在不足之處:培養細胞失去體內細胞的制約和整體的調節作用,細胞形態(tài)和功能會(huì )發(fā)生一定程度的改變。培養方法、實(shí)驗試劑對細胞形態(tài)和功能有一定的影響,如胰蛋白酶可破壞細胞表面受體、酶、抗原等。長(cháng)期體外培養的細胞,由于反復傳代、凍存和操作等因素的影響,可能發(fā)生染色體非整倍體改變,呈永生化或癌變的特征。



    材料與儀器


    二.細胞培養的基本設備與用品
    (1)細胞培養的基本設備

    細胞培養的基本設備有:CO2培養箱,倒置顯微鏡,凈化臺,壓力蒸汽消毒器,自動(dòng)雙重純水蒸餾器,液氮罐,冰箱,電熱干燥箱,電熱恒溫培養箱,電動(dòng)吸引器,抽氣泵等。

    (2)常用的實(shí)驗用品

    1.玻璃器皿

    細胞培養所用的玻璃器皿應由透明度好、無(wú)毒的中性硬質(zhì)玻璃制成。常用的有以下幾種:國產(chǎn)螺旋口培養瓶[有12.5毫升,25毫升,100毫升等規格,國外培養瓶常以底面積(平方厘米)表示];培養皿(直徑有3.5厘米,6厘米,9厘米,10厘米等規格);離心管(5毫升,10毫升);注射器(1毫升,5毫升等);用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升,250毫升,500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它還有尖吸管和移液管,載玻片(厚度0.8~1.2毫米),蓋玻片(厚度0.12毫米),貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒,漏斗,燒杯,量筒,貯蒸餾水瓶,冷凍管(1.5毫升,2毫升)等。

    2.塑料品

    多孔培養板規格有4、6、12、24、96孔等,培養皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經(jīng)消毒滅菌密封包裝,供一次性使用,重復使用的需經(jīng)特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻,有的表面經(jīng)特殊處理,細胞易于生長(cháng)。

    3.器械

    解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷、止血鉗等。

    4.雜用品

    金屬飯盒、試管架、各種規格膠塞、記號筆、搪瓷盤(pán)、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、火柴、碘酒棉球瓶等。

    組織培養中使用最多的是吸管、培養瓶、培養皿及各種瓶塞。實(shí)驗者手中應有三套器材,瓶塞數要大于瓶數,才能保證實(shí)驗中的循環(huán)使用。



    實(shí)驗步驟


    三.細胞培養用品的清洗與消毒滅菌
    (1)清 洗

    1.常用玻璃器皿清洗

    ◇清洗要領(lǐng)

    浸泡

    初次使用的玻璃器皿呈堿性,表面常附有灰塵和一些對細胞有毒的物質(zhì),如鋁和砷等??諝鉂穸雀邥r(shí),玻璃器皿表面又易長(cháng)霉。使用前,新器皿浸泡在5%稀鹽酸中過(guò)夜,以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)并去除霉斑;然后經(jīng)簡(jiǎn)單刷洗,流水沖洗(逐片進(jìn)行),蒸餾水浸泡,干燥備用。新玻片處理后,短時(shí)間不用時(shí),需將它投入95%的酒精中保存,以防玻片長(cháng)霉。培養后的玻璃器皿應立即投入清水中浸泡,器皿中殘留的細胞、蛋白質(zhì)一旦干涸,即固著(zhù)于玻璃表面,極難脫落。

    刷洗

    用過(guò)的玻璃器材經(jīng)自來(lái)水沖洗后,浸入水中煮沸,然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續煮沸10分鐘,趁熱刷洗器皿內外,刷洗后浸入清水中進(jìn)行沖洗。

    酸泡

    刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時(shí),清潔液的強氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質(zhì)。

    ◇清洗步驟

    玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時(shí)→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時(shí))→50℃烤干,待包裝。

    ◇清洗注意事項和要求

    ①使用后的實(shí)驗器材應立即投入清水中。

    ②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內要充滿(mǎn)液體,不得有氣泡。

    ③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗,不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是:每瓶灌2/3容積的自來(lái)水,振蕩后倒掉,重復15―20次(尖滴管置量杯中沖洗)。

    ④煮沸前的水面要高于器材5厘米,水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋,用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實(shí)驗器材同時(shí)從冷水煮至沸騰或使用過(guò)量洗劑,均易腐蝕玻璃表面,使玻璃堿化,pH值上升。

    ⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應該棄去,否則會(huì )損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑,會(huì )改變培養液pH值和毒害細胞。

    ⑥清潔物品應及時(shí)包裝消毒,應注意妥善保存,防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。

    ⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時(shí)煮洗時(shí),膠塞要放在煮鍋的底部。

    ⑧浸泡器材的蒸餾水容器要專(zhuān)用,并做好標記,如“蒸餾水Ⅰ盆"、“蒸餾水Ⅱ盆"。

    ⑨器材清洗干燥后,在以后各步操作時(shí),手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進(jìn)行操作,省時(shí)又保證清洗質(zhì)量。

    ⑩用超聲波儀清洗器材時(shí),清洗要求同上。

    2.橡膠制品的清洗

    新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下:0.5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0.5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來(lái)水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質(zhì)。用過(guò)的膠塞,其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑,流水沖不凈,故膠塞洗刷的重點(diǎn)部位是膠塞使用面,用刷逐個(gè)刷洗。在使用過(guò)程中,膠塞不能與培養液接觸,以防未洗凈的膠塞污染培養液和細胞。

    3.G6除菌濾器的清洗

    新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時(shí),流水緩慢沖洗,至pH值為5.5左右,然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗,再用重蒸餾水緩慢沖洗,烤干,包裝消毒備用。用過(guò)的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意:濾器千萬(wàn)不能干涸)過(guò)夜,流水緩慢沖洗24小時(shí)或更長(cháng)時(shí)間,至濾面基本疏通時(shí),50℃烤干,濾器再置清潔液中浸泡24小時(shí),或裝滿(mǎn)清潔液自然過(guò)濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。

    4.正壓除菌濾器的清洗

    新的或使用后的正壓濾器經(jīng)稀洗滌劑刷洗一次流水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時(shí)→三蒸水浸泡24小時(shí)→干燥備用。

    5.塑料制品的清洗

    塑料制品質(zhì)地軟且耐腐蝕能力強,但不耐熱,易出現劃痕。其清洗程序為:器皿用后立即用流水沖洗→浸于自來(lái)水中過(guò)夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15―20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時(shí))→晾干備用。

    6.清洗液的配制

    清潔液

    新配制的清潔液為棕紅色,遇有機溶劑或水分增多時(shí)變成綠色,表明失效。

    先在搪瓷盆中加入蒸餾水,加熱溶解重鉻酸鉀,再將盆置流 動(dòng)自來(lái)水中,待重鉻酸鉀液冷卻后,緩慢加入濃硫酸,邊加邊用玻棒攪動(dòng),以混合液溫度不過(guò)快上升和不出現重鉻酸鉀結晶為度。

    玻璃濾器洗液

    取10克硝酸鈉和28.6毫升濃硫酸,放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內混勻備用。


    清潔液配方


    配方成分
    常用方
    弱液
    次強液
    強液
    重鉻酸鉀(g)
    100
    50
    100
    60
    清水(ml)
    800
    1000
    1000
    200
    濃硫酸(ml)
    200
    90
    160
    800
    硫酸濃度(v/v)
    20%
    8%
    14%
    80%
    (2)消毒滅菌

    1.濕熱消毒

    ◇濕熱消毒的要求

    使用壓力蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱消毒。

    ①消毒物品不能裝得太滿(mǎn),物品之間應留有空隙,以利于消毒器內蒸汽的流動(dòng)。

    ②排氣管要插入消毒器的槽內。若排氣管斷裂,要將排氣管與排氣閥調至同一位置。

    ③玻璃器材使用端(管口、瓶口)要向下放置。

    ④液體消毒時(shí),用棉塞或插有針頭的膠塞封瓶口。

    ⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開(kāi)放),消毒器內空氣隨溫度升高由此閥孔逸出,容器內冷空氣隨之排出。當水煮沸時(shí),有一股較急的蒸汽沖出時(shí),將放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉)。排除冷空氣的另一種方法是:放氣閥摘子置水平位(關(guān)閉),加熱,壓力升至5磅時(shí),將摘子置垂直位(開(kāi)放),冷、熱空氣先后排出(可用手試)。待壓力指針回歸零位時(shí),放氣閥摘子再置水平位(關(guān)閉)。

    ⑥繼續加熱,當消毒器內升壓至需要壓力時(shí),計時(shí)并使壓力恒定。壓力維持方法:用電加熱時(shí),可通過(guò)電源和滅菌器間的穩壓器調節;沒(méi)有穩壓器時(shí),用放氣閥摘子自動(dòng)排氣調節;用煤氣加熱時(shí),可調節火力維持壓力。根據消毒物品種類(lèi)不同所選擇的消毒壓力和時(shí)間也不同,一般物品(如布類(lèi)、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘;橡膠制品為10磅10分鐘;常規液體消毒15磅15分鐘。一般認為在這種壓力下1分鐘內幾乎可殺死所有微生物,但由于消毒物品的包裝內仍可能留有冷空氣,而使高壓蒸汽不能達到消毒器的各部分,所以要延長(cháng)消毒時(shí)間。

    ⑦消毒完畢,待壓力指針降至零位,再等數分鐘,待放氣閥摘子放完氣后打開(kāi)消毒器蓋。液體瓶口棉塞換膠皮塞或拔去膠皮塞針頭換新塞。



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