1. 克隆培養親代細胞形成生長(cháng)旺盛、基因型一致的細胞群體，用于篩選。

2. 用無(wú)菌 NaCl 0.15 mol/L ( 0.85 % ) 稀釋 MTX，臨床使用的包裝是濃度為 2.5 mg/ml 的溶液。

3. 在幾個(gè)相同的培養瓶中分別種 2.5×105 個(gè)細胞，每個(gè)培養瓶中加入不含 MTX 或含 0.01 μg/ml、0.02 μg/ml、0.05 μg/ml 和 0.1 μg/ml MTX 的*培養基，將培養基的 pH 調至 7.4，37°C 培養 5~7 天。

4. 在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞，如果培養瓶中出現有一小部分細胞克隆生長(cháng)，其余的一些細胞是變大的，附著(zhù)在基質(zhì)層上的可能要死的細胞，選擇這種培養瓶的細胞，換含有相同量 MTX 的新鮮培養基繼續培養。

5. 如果需要，可以更換新鮮培養基，再培養 5~7 天，但是細胞必須始終處于 MTX 環(huán)境中。當細胞密度達到 2~10×106 個(gè)/瓶，將細胞以每瓶 2.5×105 個(gè)傳入新培養瓶，分別加人原濃度的 MTX 和 2~10 倍原濃度的 MTX 。

6. 5~7 天后觀(guān)察新傳代的和原來(lái)加入較高濃度 MTX 的細胞，更換培養基，選擇可用細胞，方法同前。

7. 每步傳代的細胞用逐步增高的藥物濃度持續篩選，直至獲得要求的耐藥水平。改變而獲得低到中等水平耐藥、DHFR 活性增加和（或）轉運能力改變的中同倉鼠細胞需要 2~3 個(gè)月；對于中國倉鼠細胞、小鼠細胞或生長(cháng)快的人的細胞來(lái)說(shuō)，獲得高水平耐藥性和酶過(guò)度產(chǎn)生的變異株需要 4~6 個(gè)月或更長(cháng)時(shí)間。

8. 定期凍存篩選中的細胞于液氮中。