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流式細胞術(shù)中如何辨別死細胞？

發(fā)布時(shí)間： 2021-12-01　　點(diǎn)擊次數： 2121次

流式樣品中不可能*去除死細胞，而在流式分析時(shí)又不希望有死細胞的干擾，所以如何在流式分析和流式分選時(shí)明確分辨死細胞就成為流式細胞術(shù)的一個(gè)重要研究?jì)热?。目前，有四種方法供流式分析者區分死細胞和活細胞。

（1）對角線(xiàn)死細胞
活細胞能產(chǎn)生非特異性熒光，只是非特異性熒光信號相對于熒光素發(fā)射的熒光信號較弱。死細胞也可以產(chǎn)生非特異性熒光，而且死細胞產(chǎn)生的非特異性熒光要明顯強于活細胞，有的甚至強于熒光素產(chǎn)生的熒光信號。非特異性熒光產(chǎn)生的熒光波長(cháng)沒(méi)有選擇性，并不是局限于某一熒光波長(cháng)范圍，而是處于連續的波長(cháng)范圍，所以一般所有的熒光通道都能夠接收到死細胞產(chǎn)生的非特異性熒光信號，而且其在所有波長(cháng)范圍的熒光強度相差不多，各個(gè)熒光通道接收到的死細胞的熒光強度都是處于同一個(gè)等級的。在散點(diǎn)圖上死細胞是位于對角線(xiàn)上的，而且不同的死細胞，其非特異性熒光的強度不同，且差異可能很大，強度大的可能是強度小的幾十倍，甚至幾百倍。所以從整體來(lái)看，死細胞的非特異性熒光強度呈現出從低到高的連續性分布，表現在散點(diǎn)圖上死細胞剛好處于對角線(xiàn)上，如圖A所示呈線(xiàn)型，與活細胞群體的圓形分布有明顯區別。流式分析者可以根據死細胞的這一特點(diǎn)區分活細胞和死細胞。
死細胞位于散點(diǎn)圖的對角線(xiàn)上，但是對角線(xiàn)上的細胞卻并不一定都是死細胞，因為雙陽(yáng)性細胞如果在x軸和y軸的熒光信號相似時(shí)，也可以位于對角線(xiàn)上。所以，散點(diǎn)圖對角線(xiàn)上的細胞可能是死細胞，也可能是雙陽(yáng)性細胞，但是這兩種細胞的形狀是不一樣的，死細胞呈現連續的線(xiàn)型分布，而雙陽(yáng)性細胞群呈現圓形的群體分布，可以從對角線(xiàn)上的細胞群體的形狀大致判斷細胞的性質(zhì)。圓形的雙陽(yáng)性細胞群和線(xiàn)型的死細胞群有時(shí)相互重合在一起，這時(shí)依靠散點(diǎn)圖無(wú)怯區分雙陽(yáng)性細胞和死細胞。如圖B所示，樣品細胞為正常小鼠脾臟細胞，標記FITC抗CD3抗體和PE抗CD4抗體，FITC和PE雙陽(yáng)性的CD4+T細胞與死細胞也在一起，無(wú)法區分。
如上所述，死細胞的非特異性熒光強度可以與熒光素產(chǎn)生的熒光強度類(lèi)似，所以不能根據熒光強度的強弱去區分該熒光信號是來(lái)自于死細胞的非特異性熒光還是來(lái)自于熒光素產(chǎn)生的熒光，但是可以利用在散點(diǎn)圖上死細胞位于對角線(xiàn)的特點(diǎn)來(lái)區分死細胞和陽(yáng)性的活細胞。散點(diǎn)圖可以同時(shí)反映兩個(gè)熒光通道的信息，如果X軸代表的通道是標記的熒光素接收通道，而y軸代表的通道是不標記熒光素的通道，即閑置熒光通道，這時(shí)死細胞和X軸代表的熒光素陽(yáng)性細胞在X軸的熒光信號可能相同，單從這個(gè)熒光通道信號無(wú)法區分，但是可以從散點(diǎn)圖中細胞y軸信號的大小來(lái)區分，死細胞的X軸和y軸熒光信號相似，位于對角線(xiàn)上，而陽(yáng)性細胞y軸代表的信號是陰性的，X軸代表的信號是陽(yáng)性的，位于散點(diǎn)圖的右下區域，即位于對角線(xiàn)死細胞的右下方，死細胞和陽(yáng)性活細胞可以被明顯區分。如圖C所示，X軸表示FITC通道（樣品細胞標記有FITC抗CD3抗體）、y軸表示APC通道（閑置通道），借用該散點(diǎn)圖可以明確區分圖B中無(wú)法區分的死細胞和雙陽(yáng)性細胞。此時(shí)只需將排除了死細胞后的CD3+T細胞設門(mén)，將門(mén)內的細胞顯示于新的FITC-PE散點(diǎn)圖中，如圖D所示，此時(shí)該散點(diǎn)圈內的細胞都是活細胞，因為樣品細胞同時(shí)標記有PE抗CD4抗體，所以圖中的細胞明顯分為兩群，雙陽(yáng)性的是CD4+T細胞，單陽(yáng)性的是CD8+T細胞。
（2）7AAD標記死細胞
7AAD(7氨基放線(xiàn)菌素D）是一種經(jīng)典的核酸標記染料，在流式細胞術(shù)中能夠代替PI染料用于標記死細胞，以去除死細胞對于實(shí)驗結果的影響。PI染料被激發(fā)后發(fā)射的熒光波長(cháng)范圍很大，常規FL1、FL2,FL3都能夠接收到其熒光信號，所以與FITC和PE熒光素發(fā)射的熒光波長(cháng)有很大程度的重疊，因此，PI染料不宜與FITC和PE共標記。而同樣標記核酸的7AAD，其發(fā)射的熒光波長(cháng)比較集中，一般被PerCP熒光通道接收，基本不與FITC和PE發(fā)射的熒光重疊，可以與FITC和PE共同標記樣品細胞。所以，7AAD在標記死細胞方面要明顯優(yōu)于PI染料。
7AAD的熒光信號被PerCP通道接收，所以7AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯(lián)的抗體共同標記樣品細胞。標記7AAD不需要與其他熒光素偶聯(lián)抗體同時(shí)標記，只需在流式上樣前5min加入適量的7AAD于流式管中，就可上樣分析。分析時(shí)將PerCP通道陰性的細胞設門(mén)顯示于新的流式圖中即可，此時(shí)流式圖中的細胞都是7AAD陰性的活細胞。
（3）PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞
PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的熒光波長(cháng)范圍大致為655-685nm)有時(shí)可用于識別死細胞，但首先該通道必須是閑置通道，即樣品細胞中沒(méi)有標記該通道代表的熒光素（PE-Cy5、PerCP等）偶聯(lián)抗體。選擇PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圖，一般可看到不成群的PE-Cy5陽(yáng)性細胞，這些陽(yáng)性細胞的SSC值也是散在分布的，這些散在的PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞一般都是死細胞，如下圖所示。PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞，即圖A中的設門(mén)部分，將這部分細胞設門(mén)顯示于FITC-PE散點(diǎn)圈中，如圖B所示，這部分PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞基本都位于對角線(xiàn)部分，而對角線(xiàn)細胞一般就是死細胞，所以，散在的PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞一般就是死細胞。
利用PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞區分活細胞和死細胞時(shí)，流式圖分析的順序一般是先在FSC-SSC圖中選擇目標細胞所在的細胞群，將其設門(mén)，然后將門(mén)內的細胞顯示于PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圈中，排除PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞代表的死細胞，將PE-Cy5陰性細胞設門(mén)，然后將門(mén)內的細胞顯示于新的流式圖內分析，這時(shí)該流式圖內的細胞都是活細胞，分析或者分選時(shí)就可以盡量排除死細胞的干擾了。
但是，這種排除死細胞的方法只是一種經(jīng)驗方法，一般在實(shí)驗要求不高或者預實(shí)驗時(shí)使用，PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性細胞并不一定都是死細胞，死細胞也并不一定都位于PE-Cy5通道非標記陽(yáng)性區域內，其陰性區域內也可能有一定比例的死細胞。所以，流式分析者可以借鑒這種方法區分死細胞和活細胞，但是不能將此方提作為區分死細胞和活細胞的金標準，7AAD標記法才是標記死細胞的金標準。
（4）EMA與ViD標記死細胞
只標記分析活細胞的表面抗原分子時(shí)，用7AAD鑒別死細胞和活細胞是理想且經(jīng)典的方法。但是如果分析胞內分子，如檢測胞內的重要抗原分子、胞內細胞因子和胞內活化的激酶等都需要先固定樣品細胞，然后用打孔劑在細胞膜上打孔，使熒光素偶聯(lián)抗體能夠通過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞內，與相應目標分子結合，這時(shí)7AAD就無(wú)怯鑒別死細胞和活細胞了。如果在固定細胞前標記7AAD，固定和打孔的過(guò)程可能會(huì )使7AAD發(fā)射熒光的能力丟失，如果在上樣前標記7AAD，那所有的細胞都會(huì )被標記，因為7AAD也可經(jīng)過(guò)小孔進(jìn)入細胞內部與DNA結合。這時(shí)，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反應性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞內分子時(shí)用于鑒別死細胞和活細胞。
EMA與PI和7AAD一樣也是一種能夠與DNA結合的熒光染料，但不能自由通過(guò)活細胞的細胞膜，當細胞死亡細胞膜通透性增加時(shí)就可以進(jìn)入細胞內與DNA結合。EMA比PI和7AAD穩定，標記胞內分子時(shí)的固定和打孔操作不會(huì )影響EMA發(fā)射熒光信號的能力，在固定前標記EMA就可排除死細胞的影響。但是，EMA只有暴露在紫外條件下才能夠與DNA共價(jià)結合，而且EMA的熒光信號較弱。
ViD是一種新型鑒定活細胞和死細胞的熒光染料，它與EMA一樣穩定，固定和打孔的操作不會(huì )影響其發(fā)射熒光的能力，在分析胞內分子時(shí)，固定前標記ViD可鑒別死細胞和活細胞，而且其標記過(guò)程簡(jiǎn)單，熒光信號也較強，具有較好的應用前景。

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