本期分享第三期的細胞培養常見(jiàn)問(wèn)題的內容，希望對大家有所幫助啦~

20. 如果細胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應如何處理？

原則上：直接滅菌后丟棄之。

當重要的培養污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過(guò)濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實(shí)驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè )菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實(shí)驗步驟。

(1)  在無(wú)抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。

(2)  分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個(gè)小培養瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

(3)  每天觀(guān)測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。

(4)  確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。

(5)  在無(wú)抗生素的培養基中培養細胞一代。

(6)  重復步驟4。

(7)  在無(wú)抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。

21. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀(guān)察出異狀？

不能。除極有經(jīng)驗之專(zhuān)家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無(wú)法以其外觀(guān)分辨之。

22. 支原體污染會(huì )對細胞培養有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長(cháng)參數，代謝及研究的任一數據。故進(jìn)行實(shí)驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實(shí)驗結果的數據方有意義。

23. 偵測出細胞株有支原體污染時(shí)， 該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株，但是如果您的樣本珍貴，建議您使用支原體去除試劑去除污染

24. CO2 培養箱的水盤(pán)如何保持清潔？

定期(至少每?jì)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

25. 為何培養基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會(huì )偏暗紅色，且pH值會(huì )越來(lái)越偏堿性？

培養基保存于4℃冰箱中，培養基內的CO2會(huì )逐漸溢出，造成培養基越來(lái)越偏堿性。而培養基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì )隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿的結果，將造成細胞生長(cháng)停滯或死亡。若培養基偏堿時(shí)，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2，以調整pH 值。

26. 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？

不同廠(chǎng)牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒(méi)有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠(chǎng)牌不同的dish 或flask 而有顯著(zhù)的生長(cháng)差異。

27. 購買(mǎi)的細胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì )發(fā)生細胞數目太少的情形？

研究人員在冷凍細胞的培養時(shí)出現細胞數目太少，大都是因為離心過(guò)程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長(cháng)隔夜后再更換培養基即可。

28. 購買(mǎi)的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養時(shí)出現存活率不佳，常見(jiàn)原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80℃太久。

29. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作:

(1)  解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)  解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)  請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì )變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩定的成分也會(huì )因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)  血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。

(5)  若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì )造成沉淀物的增多。

30.  L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì )降解，但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

31.  GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩定？

GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121℃滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

32. 什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中用作PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類(lèi)激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類(lèi)反應，培養細胞，尤其是哺乳類(lèi)細胞時(shí)，不用加。

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