材料與儀器

反轉錄酶 末端脫氧核苷酸轉移酶 末端轉移酶緩沖液 熱穩定 DNA 聚合酶
擴增緩沖液 氯仿 dATP dNTP 貯存液 胎盤(pán) RNase 抑制劑 TE 反轉錄酶緩沖液
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠 制備型離心機 SorvallSS - 34 轉頭

步驟

一、材料

1. 緩沖液與溶液

10X 擴增緩沖液

氯仿

dATP ( 1 mmol/L，二鈉鹽）

4 種 dNTP 貯存液（20 mmol/L, pH 8.0)

胎盤(pán) RNase 抑制劑（20 單位/μl)

TE ( pH 7.6)

2. 酶與緩沖液

5X 反轉錄酶緩沖液

反轉錄酶（RNA 依賴(lài)的 DNA 聚合酶）

末端脫氧核苷酸轉移酶（末端轉移酶）

5X末端轉移酶緩沖液

熱穩定 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠

4. 核苷酸與寡核苷酸

接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCG3'）溶于水中（10 pmol/μl）

（接頭引物可以與基因特異性正向引物聯(lián)合在一起用于擴增特異性靶 cDNA。第一步 PCR 擴增后，PCR 目的產(chǎn)物可能僅占總 DNA 產(chǎn)物的 1%，也可能多至占總 DNA 產(chǎn)物的 100%。如果必要，可用第一輪 PCR 產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二輪嵌套式 PCR，改善目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，該輪 PCR 的引物為接頭引物與另一個(gè)基因特異性正向引物。在第二輪嵌套式 PCR 擴增后，幾乎所有的擴增產(chǎn)物在 EB 染色下呈現了靶 mRNA 的 5' 區域序列相一致的條帶。

RT-PCR 的引物用自動(dòng) DNA 合成儀合成，用于標準 RT-PCR 的引物一般不需要進(jìn)一步純化。然而，如果寡核苷酸引物經(jīng)商品化的樹(shù)脂進(jìn)行柱層析純化（如 NENLife- Science 公司產(chǎn)品 NENSORB) 或者經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化，純化后的引物用于擴增低豐度的 mRNA 時(shí)常常會(huì )更有效。）

（dT)17-接頭引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173'）溶于水中（10 pmol/μl)

基因特異性反義寡核苷酸引物（10 μmol/L) 溶于水（10 pmol/μl）。

（基因特異性反義寡核苷酸引物應該與靶 mRNA 的已知序列互補，其長(cháng)度在 20~ 30 bp，內含的 4 種堿基數量基本相等，G 與 C 堿基的平衡分布以及引物具有較低的自發(fā)形成穩定二級結構的傾向?；蛱禺愋砸?1 用于步驟 2, 用反轉錄酶引導基因特異性第一鏈 cDNA 的合成?；蛱禺愋砸?2 是與靶 mRNA 的 5'序列互補的，用于 5'-RACE 反應的擴增階段?；蛱禺愋砸?2 也總是被插入適當的限制性?xún)惹泻怂崦该盖形稽c(diǎn)，這樣便于擴增 cDNA 的進(jìn)一步克隆。）

隨機六核苷酸溶于 TE ( 1 mg/ml，pH 8.0)

總 RNA（100 μg/ml）或 poly (A)+ RNA（10 μg/ml）溶于水中

（總 RNA一般用離液劑（chaotropic agents) 從細胞中抽提的，選擇總 RNA 作模板一般適用于從中等程度到高豐度 mRNA 中通過(guò) RT-PCR 克隆靶基因。對于低豐度靶 mRNA 的樣品最好選擇 poly (A) + RNA 作模板進(jìn)行 RT-PCR。運用作為 RT-PCR 模板的 RNA 也可以從如下的少量培養細胞中制備。）

5. 離心機與轉頭

制備型離心機

SorvallSS - 34 轉頭

6. 特殊設備

自動(dòng)微量移液器的屏蔽型槍頭

濃縮器（Centricon-100，Amicon 產(chǎn)品）

微量離心管（0.5 ml，薄壁擴增反應專(zhuān)用離心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR 儀

旋轉真空冷凍干燥機（可選擇）

水浴箱預設在 75℃ 和 80℃

二、方法

反轉錄

在實(shí)驗開(kāi)始時(shí)，首先要確定 5'-RACE 是否成功。如果反轉錄步驟是有效的，那么分離到含有靶 mRNA 的 5' 末端序列的克隆的幾率是較高的。另一方面，如果反轉錄步驟是無(wú)效的，那么本方案的后續步驟是無(wú)法補償的。因此，對于反轉錄反應條件是值得花時(shí)間優(yōu)化的，如最佳的引物與模板比例，改變反應體系 Mg2+ 濃度，尋找最適的 Mg2+ 濃度。

1. 轉移 1 pg 至 100 ng 的 poly (A) + RNA 或 1 μg 總 RNA 到一只新的離心管。用水調整體積至將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min, 將離心管插入冰中冷卻。

2. 向這種含有已變性的 RNA 樣品的離心管內依次加入如下試劑：

5X 反轉錄酶緩沖液                                 4 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液（pH 8.0）  1 μl

10 μmol/L 基因特異性反義引物 1             4 μl

約 20 單位/μl 胎盤(pán) RNase 抑制劑             1 μl

水補足至                                                20 μl

反應管溫育在反應 60 min。設置 3 支陰性對照管。在一支對照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應所需的所有試劑，但不加模板 RNA；第二支對照管加入除了反轉錄酶外的所有試劑；第三支對照管中加入除引物外的所有試劑。這些對照管進(jìn)行所有的后續步驟。設置這些對照管能保證 cDNA 產(chǎn)物不是由于基因組 DNA 與寡核苷酸片段的污染或者由 RNA 模板分子的自身引導所致。

反轉錄產(chǎn)物的純化

反轉錄反應完成后，多余的 dNTP 和引物必須從反應液中去除。此外，dNTP 在反應液中的存在，一方面可能由末端轉移酶在  cDNA 的 3' 末端加尾，另一方面還可能危及第一鏈 cDNA 尾部序列作為引物結合位點(diǎn)的能力。多余的引物的存在也會(huì )造成不利的影響，因為引物的 3' 末端會(huì )與 cDNA 的加尾反應相競爭。

3. 去除過(guò)剩的寡核苷酸或隨機六核苷酸引物可用水將反應液終體積稀釋至 2 ml, 然后用 Centicon-100 微量濃縮器（Frohman 1993; for a description of this procedure， please see protocol 3 )。離心轉速為 500~1100 g ( 2000~3000 r/min, 用 Sorvall SS34 轉頭）， 溫度在 4℃ 和 25℃ 之間離心 20 min。重復用水稀釋步驟和離心步驟。轉移潴留的液體到一支新的 0.5 ml 離心管，用旋轉真空抽干機使體積濃縮至 10 μl。

4. 加入 10 體積的如下試劑至反轉錄 cDNA 樣品中：

5X 末端轉移酶緩沖液    4 μl

1 mmol/L dATP            4 μl

末端轉移酶                  10~25 單位

反應管孵育在 37℃ 水浴中反應 15 min。

5. 在 80℃ 放置 3 min 使末端轉移酶滅活。使帶有 dA 尾的 cDNA 樣品用 TE pH 7.6 稀釋至終體積 1 ml。

擴增

6. 按以下次序，將各成分加入在一只 0.5 ml 滅菌離心管、擴增管或滅菌微量滴定板的孔內，建立 PCR 系列反應管：

已稀釋 cDNA                                       0~20 μl

10X 擴增緩沖液                                    5 μl

20 mmol/L 4 種 dNTP 混合液                 5 μl

10 μmol/L (dT)17-接頭引物（16 pmol）   1.6 μl

10 μmol/L 接頭引物（32 pmol）             3.2 μl

10 μmol/L 基因特異性引物 2 ( 32 pmol )  3.2 μl

1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶                  1 μl 

H2O 補足至                                          50 μl

如果實(shí)驗必要，可建立系列的擴增試驗管用于篩選 cDNA 加尾模板產(chǎn)生最大量的擴增 5' 末端。

7. 如果 PCR 儀沒(méi)有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl），防止樣品在 PCR 反應多個(gè)加熱與冷卻的循環(huán)過(guò)程中蒸發(fā)。如果應用熱啟動(dòng) PCR 程序，在反應混合液上層加一滴石蠟油。放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。

8. 按以下方法進(jìn)行 PCR 擴增。典型的程序有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環(huán)條件與溫度列表如下：

9. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析擴增結果，用 DNA marker 來(lái)判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色后來(lái)觀(guān)察擴增的量與片段大小。

10. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟 7)，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

11. 從擴增的 DNA 產(chǎn)物中分離掉殘余的熱穩定 DNA 聚合酶和 dNTP。

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