01

1. 將水浴鍋提前預熱至37℃

2. 細胞實(shí)驗室進(jìn)行常規消毒，用75％酒精擦拭紫外線(xiàn)照射40min的超凈工作臺臺面，保證無(wú)菌。

3. 在超凈工作臺中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養瓶等即將使用的耗材及試劑。

02

1. 根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。

2. 從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時(shí)核對管外的編號。

03

1. 迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

2. 約1-2min后凍存管內液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

04

用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機中3000r/min?離心3分鐘。

05

1. 吸棄上清液。

2. 向離心管內加入10ml*培養液，吹打制成細胞懸液。

3. 用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，放入培養箱中培養。

06

細胞濃度以5×105/ml為宜。

07

將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶?jì)?，將培養瓶放入37℃，5％CO₂的培養箱內2-4h（或者24-48h）后換液繼續培養培養，換液的時(shí)間根據細胞情況而定。

08

1. 注意無(wú)菌操作。
2. 取細胞的過(guò)程中可能會(huì )接觸液氮，一定注意帶好防凍手套，護目鏡。
3. ☆此項尤為重要，如果凍存管密封不嚴，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)，在水浴中搖晃，凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸，所以，一定要戴保護眼鏡和手套。
4. 應在1-2min內使凍存液*融化。如果復溫速度太慢，則會(huì )造成細胞損傷。另外，細胞復蘇后的操作最好在4℃冰浴中進(jìn)行，以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。
5. 細胞復蘇過(guò)程中，升溫的速率要大，把從液氮或-70℃水箱中取出的細胞在最短的時(shí)間內放入水浴鍋中進(jìn)行解凍。
6. 離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少其對細胞的損傷。
7. 細胞貼壁少的問(wèn)題：教科書(shū)中說(shuō)明凍存細胞解凍時(shí)1ml細胞液要加10ml－15ml培養液，經(jīng)驗總結，培養基越少細胞越容易貼附。
8. 復蘇細胞分裝的問(wèn)題：復蘇1管細胞一般根據情況可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過(guò)多，細胞濃度過(guò)低，不利于細胞的貼壁。
9. 加培養基的量放入問(wèn)題：這個(gè)量的多少的把握主要涉及到的問(wèn)題是DMSO的濃度，從如果加培養基的太少，DMSO的濃度就會(huì )比較大，就會(huì )影響細胞生長(cháng)，從以前的資料來(lái)看，DMSO的濃度在小于0.5%的時(shí)候對一般細胞沒(méi)有什么影響。還有一個(gè)說(shuō)法是1％。所以如果凍存液的濃度是10％DMSO，那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無(wú)害濃度。  

結果分析

判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內剩余的細胞，用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著(zhù)色。用細胞計數板和計數器計數細胞，得出細胞存活率）。

如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說(shuō)明細胞復蘇的過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題。復蘇的細胞恢復到正常生長(cháng)，達到正常的生長(cháng)特性（比如細胞群體倍增時(shí)間等）后要再凍存以補充細胞儲存數量。