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Real-time PCR實(shí)驗攻略（基本方法一）
發(fā)布時(shí)間： 2022-03-11 點(diǎn)擊次數： 4200次材料與儀器
步驟
實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time PCR）實(shí)驗流程
一、RNA的提取(詳見(jiàn)RNA提取及反轉錄)
不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實(shí)驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實(shí)驗過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；取2ug進(jìn)行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時(shí)，要用DNase I進(jìn)行消化（因為在處理過(guò)程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑）二、DNase I 消化樣品RNA 中的DNA
三、RNA瓊脂糖凝膠電泳
1. 1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：
1） 稱(chēng)取瓊脂糖0.45 g放入三角瓶中，向其中加入4.5 ml的10×MOPS緩沖液和39.5 ml的DEPC水，放微波爐里溶化。
2） 待冷卻到60攝氏度左右時(shí)，加入1 ml甲醛，搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。倒入凝膠板上凝固30 min。
2. 取各個(gè)RNA樣品4 μl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2 μl混勻，加入變性膠加樣孔中。
3. 120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀(guān)察，照相保存。
另外還有一種RNA檢測方法：濃度檢測：取4 μl RNA，加蒸餾水至1 000 μl，混勻。測OD260、OD280
四、RNA反轉錄為cDNA
反轉錄程序(以MBI的M-MLV為例)
反轉錄引物的選擇與Real-Time PCR引物設計的要求
1）隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難以拷貝其全長(cháng)序列時(shí)，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來(lái)拷貝全長(cháng)mRNA。用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過(guò)程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。特別適合檢測多個(gè)基因的表達，這樣可以節約反轉錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平。
3）特異性引物：最特異的反轉錄方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA3'端最靠近的配對引物起始。用此類(lèi)引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。做 Real Time PCR時(shí)，用于SYBR Green I/Eva Green 法時(shí)的一對引物與一般PCR的引物，在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求：
① Tm=55-65 ℃
② GC=30-80%
③ PCR擴增產(chǎn)物長(cháng)度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-300 bp之間都可。
④ 引物的退火溫度要高，一般要在 60 ℃以上。
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時(shí)應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。至于設計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應該可以的。做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不易。
五、cDNA與引物質(zhì)量檢測取0.2 ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10 ul；加入正反向引物各0.5 ul（引物濃度10 uM） ，向管中加入混合的cDNA各1 ul。各管補加水至20 ul。組份 加量2×PCRTaqMix 10 ul10 uMPrimer FW 0.5 ul10 uMPrimer RV 0.5 ulTemplate DNA 1 ulddH2O 混勻至20 ul
混勻，置于TP600PCR儀中。95 ℃ 5 min；95 ℃15 s，60 ℃35 s ，40 cycles；72 ℃ 5 min；4 ℃ pause。取擴增產(chǎn)物各8 μl，DL2000 分子量標準5 μl/泳道。1%瓊脂糖凝膠120V電壓下電泳25 min。用凝膠紫外分析儀觀(guān)察。
選擇特異性好，擴增效率高的引物作為實(shí)時(shí)熒光使用引物。
六、利用相對定量的方法分析目的基因表達量的情況由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀(guān)因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進(jìn)行基因表達調控研究中都會(huì )用一些看家基因來(lái)標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調控分析時(shí)至少要做兩個(gè)基因，目的基因和一個(gè)看家基因。
七、定量 PCR檢測取0.2 ml薄壁PCR管，分別編號。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5 ul，10 uM各基因正反向引物混合物0.5 ul，對應的cDNA各1 ul。一管中不加模板用作陰性對照。各管補加水至25 ul。
混勻，置于SLAN熒光定量PCR儀中。95℃5min預變性后，95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測），40 cycles。熒光定量PCR一般把退火和擴增設成一個(gè)溫度，只在擴增出現問(wèn)題時(shí)才會(huì )考慮設梯度。
（侯哥論文中的：95 °C 10分鐘→95 °C 15秒→60 °C 1分鐘；40個(gè)循環(huán)。）
以雙△Ct值法計算靶基因相對表達水平：
GRP78相對表達水平=2-△(△CT)
注：△CT =Ct(GRP78)-Ct(GAPDH); △(△CT)= △CT (LLLI)- △CT (contro1)。
如果在熒光背景信號階段出現很多拐點(diǎn)，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì)；如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。如果引物二聚體存在則陰性對照會(huì )出現抬頭現象，這在Real-Time PCR中很難避免；若是陰性對照的溶解曲線(xiàn)出現和樣品中同樣的峰，說(shuō)明體系配置中存在污染，則實(shí)驗結果不可用。
在溶解曲線(xiàn)中出現雙峰有三種可能：
① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個(gè)，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設計引物；
② 在做基因表達差異時(shí)容易出現DNA被擴增峰（只在引物跨內含子時(shí)存在），出現原因是提取RNA時(shí)存在DNA污染，可以通過(guò)電泳驗證，這時(shí)要重新消化RNA樣品中的DNA；
③ 擴增非特異，這時(shí)要重新摸擴增條件或重新設計并驗證引物。
八、表達差異的計算方法絕對定量通過(guò)標準曲線(xiàn)計算起始模板的拷貝數；相對定量方法則是比較經(jīng)過(guò)處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標轉錄本或是目標轉錄本在不同時(shí)相的表達差異之間的表達差異。
2-△△CT方法是實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗中分析基因表達相對變化的一種簡(jiǎn)便方法。
在有些情況下，并不需要對轉錄本進(jìn)行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說(shuō)X基因在經(jīng)過(guò)某種處理后表達量增加2.5倍比說(shuō)該基因的表達從1000 拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀(guān)。
2-△△CT方法的推導（詳見(jiàn)實(shí)時(shí)定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量）
補充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對樣品重新進(jìn)行氯仿抽提，具體實(shí)驗流程如下：
消化后總體積100 ul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200 ulDEPC水。
1. 向離心管中加入等體積氯仿（約300 ul） ，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現白色片狀沉淀。4℃14 000 rpm離心8 min，取上清（約250 ul）。
2. 加入1/10體積的NaAC（3 M）（約25 ul）和預冷的等體積異丙醇（約280 ul），-20℃放置20 min。
3. 4℃14 000 rpm離心15 min，去上清，注意不要觸到沉淀。
4. 加入1 ml的75%乙醇，4℃14 000 rpm離心3 min，去上清。
5. 瞬時(shí)離心，用200 ul（或10 ul）的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(tài)（勿吸到管底的沉淀）。
6. 把離心管放置于超凈臺晾至約5-10 分鐘（勿*干燥，否則很難溶）。加入30~50 μl的無(wú)RNase的水，靜止1 min 后，振蕩30sec，瞬時(shí)離心。
7. 將提取的RNA立即進(jìn)行下游實(shí)驗，或放-20 ℃保存。注意事項
北京協(xié)和醫學(xué)院阜外心血管病醫院心外科心血管病國家重點(diǎn)實(shí)驗室吳益和分享實(shí)驗中必須堅持的一些好習慣1. 加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長(cháng)了濃度不均。2. 移液槍用完之后要歸到最大計量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性。3. 所有的試劑都自己配，出了問(wèn)題才好找原因一. 防止RNA酶污染的措施。一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180 ℃的高溫下干烤6 h或更長(cháng)時(shí)間。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10 min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37 ℃處理12 h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。5. 操作人員戴一次性口罩. 帽子. 手套，實(shí)驗過(guò)程中手套要勤換。6. 設置RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗室，所有器械等應為專(zhuān)用。同實(shí)驗其他方法
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
一、 樣品RNA的抽提 1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。 2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后
Real-time PCR實(shí)驗攻略（基本方法二）
二、DEPC處理方法如下1. DEPC處理（1）DEPC水：100 ml超純水加入0.2 ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。（2） Tip頭(槍頭）. EP管等在提RNA過(guò)程中及做RT時(shí)接觸RNA的
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