1 簡(jiǎn)述

Western Blot（簡(jiǎn)稱(chēng)WB），蛋白質(zhì)免疫印跡法，是基于蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分離和特異性抗體識別蛋白的特性，通過(guò)顯色技術(shù)，以達到檢測目的蛋白的技術(shù)。該技術(shù)廣泛應用于定性檢測蛋白水平的表達，活性分析與鑒定。該實(shí)驗步驟多，關(guān)鍵點(diǎn)多，耗時(shí)長(cháng)，每個(gè)步驟可能都影響最終的結果，所以實(shí)驗中經(jīng)常出現各種問(wèn)題。本文對WB實(shí)驗中常出現的各種問(wèn)題進(jìn)行歸納總結，并給出相應的解決方法，以便了解WB實(shí)驗中的注意點(diǎn)和規范操作的必要性，同時(shí)對WB出現的問(wèn)題分析和解決提供參考。

2 實(shí)驗原理

WB以組織或細胞中的蛋白質(zhì)為研究對象，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應的一抗起免疫反應，再與酶或同位素標記的二抗起反應，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

3 實(shí)驗流程圖

WB實(shí)驗流程圖

4 常見(jiàn)問(wèn)題可能原因和解決辦法

WB實(shí)驗步驟較多，耗時(shí)均較長(cháng)，且每步都影響最終的結果表現。我們將常見(jiàn)問(wèn)題總結歸納為5大類(lèi)，見(jiàn)表4-1。下面將對各問(wèn)題進(jìn)行分類(lèi)總結，并對出現該現象的原因進(jìn)行分析，給出相應的解決辦法。

表4-1 常見(jiàn)問(wèn)題分類(lèi)

4.1 無(wú)信號，沒(méi)有陽(yáng)性條帶

WB結果中常出現白板或者條帶無(wú)信號響應現象，如圖4-1。我們針對出現該現象可能的原因主要從抗體，抗原，實(shí)驗操作和緩沖液幾方面進(jìn)行分析。

4.1.1 抗體相關(guān)原因

WB中所用到抗體包括一抗和二抗，在該問(wèn)題上，兩個(gè)抗體方面可能存在的原因以及相對應的解決方法，歸納總結在表4-2中。

表4-2 抗體相關(guān)原因

4.1.2 抗原相關(guān)原因

抗原即所需要檢測目的蛋白，其相關(guān)原因可能是未被一抗識別或者是抗原量不足引起，相對應解決辦法見(jiàn)表4-3。

表4-3 抗原相關(guān)原因

4.1.3 實(shí)驗操作相關(guān)原因

實(shí)驗操作規范對于實(shí)驗結果也至關(guān)重要，且需要重復摸索。無(wú)條帶出現可能是目標蛋白未從膠轉移至膜上或者洗膜過(guò)度，具體分析見(jiàn)表4-4。

表4-4 實(shí)驗操作相關(guān)原因

4.1.4 緩沖液相關(guān)原因

實(shí)驗中用到多種緩沖液，緩沖液的選擇和保存，以及選擇合適的顯色方式都很重要。無(wú)目標蛋白出現可能與緩沖液有關(guān)的原因和解決方法見(jiàn)表4-5。

表4-5 緩沖液相關(guān)原因

4.2 有陽(yáng)性條帶，但條帶信號弱

WB結果中可能出現有目標蛋白條帶，但是目標條帶在膜上顏色較淺，如圖4-3。該現象原因與4.1中無(wú)目標條帶較為相似，可能導致該現象的原因我們也從4個(gè)方面進(jìn)行分析，并給出相應的解決方法，具體分析見(jiàn)表4-6。

圖4-3 條帶信號弱案例

表4-6 條帶信號弱可能原因和解決方法

4.3 條帶或位置異常

條帶或者位置異常是指條帶形狀異常和條帶在膜上與理論位置不一致。條帶形狀異常常與電泳問(wèn)題有關(guān)，SDS-PAGE電泳的質(zhì)量至關(guān)重要。條帶位置異?？赡苁堑鞍壮霈F聚體或被修飾，蛋白出現降解有關(guān)。下面就可能出現的各個(gè)問(wèn)題結合實(shí)際案例詳細討論。

4.3.1 微笑條帶

電泳條帶或整體出現 “︶ "形狀，如圖4-4和4-5，可能原因主要包括兩方面。一是電泳速度過(guò)快，可通過(guò)減少電壓等減慢電泳速度。二是電泳溫度過(guò)高，使得膠變形，可在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳或者改變電泳pH。

4.3.2 皺眉條帶

與微笑狀條帶相反，條帶成現“︵"皺眉狀，可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不全?？赏ㄟ^(guò)調整裝置來(lái)避免該問(wèn)題。如圖4-6。

圖4-6 皺眉條帶

4.3.3 某條條帶變形

WB結果中其它條帶均正常，某條條帶出現變形，如圖4-7所示，出現該現象可能的原因是SDS-PAGE膠中有氣泡或者不溶性顆粒。我們在配膠過(guò)程中要小心，使用無(wú)雜質(zhì)的液體。

圖4-7 條帶變形

4.3.4 啞鈴狀條帶

結果中出現條帶呈現啞鈴狀，如圖4-8，該現象可能有兩個(gè)原因導致。一是由于配置膠有問(wèn)題，膠凝固后不均一，可通過(guò)重新配置膠，確保膠質(zhì)量無(wú)問(wèn)題來(lái)避免該現象出現。二是樣品可能含有過(guò)多雜質(zhì)，我們在樣品使用前對其進(jìn)行離心，以去除過(guò)多雜質(zhì)。

圖4-8 啞鈴狀條帶

4.3.5 條帶粘連

條帶粘連是不同孔目標條帶連在一起，中間無(wú)間隔，如圖4-9所示。出現該現象的原因可能是上樣量太多，或者是制膠問(wèn)題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔?？赏ㄟ^(guò)減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來(lái)避免該問(wèn)題。

圖4-9 條帶粘連

4.3.6 分子條帶大小不對

分子條帶大小，即條帶位置異常，主要包括三種情況。第一種是出現高于目標蛋白較多的條帶，如圖4-10，該現象可能是由于蛋白未充分變性，導致蛋白形成二聚體或者多聚體。為避免該現象，可在實(shí)驗之前加入新配的DTT或?-ME，重新加熱使得蛋白充分變性或者直接使用新的蛋白樣本。第二種是出現略高于目標蛋白的條帶，如圖4-11，該現象可能是由于蛋白被修飾，如糖基化/磷酸化等，可導致分子量增加。解決方法是嘗試使用酶去除可能的蛋白修飾。第三種是出現比目標蛋白略低的條帶，如圖4-12，該現象可能是由于蛋白翻譯后剪切或者降解。在樣品準備時(shí)候要在冰上操作或者是加入更過(guò)蛋白酶抑制劑，以防止蛋白降解。

4.4 高背景

高背景是WB中常出現的問(wèn)題，本文將高背景分為兩類(lèi)討論，包括均一性高背景和斑點(diǎn)或發(fā)泡式或閃爍式非均一性高背景。下面針對兩種情況均從抗體，實(shí)驗操作和緩沖液方面進(jìn)行分析討論，并給出相應的解決方法，以減少背景，得到漂亮真實(shí)可靠的WB結果。

4.4.1 均一性高背景

均一性高背景在實(shí)驗中常常出現，如圖4-13，可能導致該現象的原因較多，均總結于表4-7中，并給出相應的解決方法。

圖4-13 均一性高背景

表4-7 均一性高背景原因和解決方法

4.4.2 斑點(diǎn)或發(fā)泡式或閃爍式非均一性高背景

出現非均一性高背景結果的原因與均一性背景有很多相似之處，也存在差別，如蛋白聚體的影響，非均一性高背景案例圖如圖4-14所示，可能原因見(jiàn)表4-8。

圖4-14 非均一性高背景

表4-8 非均一性高背景原因和解決方法

4.5 非特異性條帶多

非特異性條帶是指除目標蛋白以外的條帶，雜帶較多影響結果判斷，且結果不可靠。下面我們結合實(shí)際案例對其可能原因進(jìn)行分析，并找出相對應的解決方法，見(jiàn)表4-9。

表4-9 非特異性條帶多可能原因和解決方法

4.6 其它問(wèn)題

4.6.1 反白現象

反白現象是蛋白條帶中間空白，而周?chē)尘罢?，如圖4-18所示。該現象可能原因是一抗濃度過(guò)高，二抗上HRP催化活力太強，同時(shí)顯色底物處于臨界點(diǎn)，反應時(shí)間不長(cháng)，將周?chē)孜锎呋?，形成了空白?？山档鸵豢购投節舛?，或者更換底物來(lái)避免該現象。

圖4-18 反白現象

4.6.2 條帶中間或周?chē)霈F白圈

條帶中間白圈（如圖4-19）可能是由于電轉中膜和膠之間存在氣泡。在轉膜過(guò)程中要盡量去除氣泡，使膜，濾紙和膠緊密結合。同時(shí)，抗體孵育的過(guò)程中，保持膜的充分浸潤。

圖4-19 條帶中間白圈

后記

WB因結果直觀(guān)易分析為蛋白研究中最為常用的方法之一，但也因為其步驟繁雜結果變幻莫測成為很多新手的夢(mèng)魘。相信看完本文的小伙伴一定會(huì )有所感悟，把握好基本原則：先做出條帶，再優(yōu)化結果。好看的結果千篇一律，有趣的條帶五花八門(mén)，且把它們看作是枯燥科研中的小點(diǎn)綴吧~