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蛋白質(zhì)分離實(shí)驗
發(fā)布時(shí)間： 2022-12-01 點(diǎn)擊次數： 833次簡(jiǎn)介
蛋白質(zhì)分離的方法主要有 3 種：SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)、免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)。
原理
SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)的基本原理是蛋白質(zhì)在 SDS 和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵打開(kāi)，形成帶負電荷的 SDS-蛋白質(zhì)復合物，聚丙烯酰胺（PAGE）是一種具有三維結構的網(wǎng)狀高分子聚合物，具有分子篩的作用。蛋白質(zhì)在 PAGE 電泳中向正極遷移，遷移速率取決于分子的大小、電荷及其空間結構。SDS 帶有較強的負電荷，不同的蛋白質(zhì)與之結合后具有相同的荷質(zhì)比，并具有相似的空間構象，使得 SDS-蛋白質(zhì)復合物在 PAGE 中的遷移速率只與蛋白質(zhì)的分子大小相關(guān)。免疫沉淀法分離蛋白質(zhì)的基本原理是是利用特異的抗體從細胞裂解物中分離目的蛋白的一種沉淀方法。該方法首先要制備細胞裂解液，然后將特異性抗體加到細胞裂解液中，4 ℃ 下孵育一定時(shí)間后，再加入可以與特異性抗體結合的固相化分子使之形成不溶性抗原-抗體復合物而沉淀。將沉淀下來(lái)的抗原-抗體復合物在含有 SDS 和 DTT 的緩沖液中加熱后，使被沉淀的抗原釋放出來(lái)，經(jīng)電泳分離后即可用各種方法檢測。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)是根據蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級屬性-等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物在電荷（等電聚焦，IEF）和分子質(zhì)量（變性聚丙烯酰胺凝胺電泳，SDS-PAGE）兩個(gè)水平上進(jìn)行分離。2D-PAGE 的第一向電泳是等電聚焦電泳（IEF），蛋白質(zhì)因所帶凈電荷的不同而被分離開(kāi)；然后對蛋白質(zhì)進(jìn)行第二向電泳-SDS-PAGE，在 SDS-PAGE 中，不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)相互間分離開(kāi)。由于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和所帶凈電荷是兩個(gè)彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)，而 2D-PAGE 同時(shí)利用了蛋白質(zhì)間在這兩個(gè)性質(zhì)上的差異分離蛋白質(zhì)。
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