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多潛能干細胞的誘導
發(fā)布時(shí)間： 2022-12-02 點(diǎn)擊次數： 832次簡(jiǎn)介
多潛能干細胞（in-duced pluripotent stem cells，iPS）技術(shù)不僅可以解決胚胎干細胞來(lái)源引起的倫理問(wèn)題，而且自體 iPS 細胞可以避免異體來(lái)源胚胎干細胞移植引起的免疫排斥反應。目前就成體細胞誘導產(chǎn)生 iPS 細胞相關(guān)的幾種轉錄因子以及誘導方法、如何提高誘導產(chǎn)生 iPS 細胞的效率以及 iPS 細胞臨床應用方面都是在 Yamanaka 報道的誘導方案基礎上的改良。
原理
Yamanaka 法誘導多能干細胞的原理是把 Oct3/4，Sox2、c-Myc 和 Klf4 這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發(fā)現可誘導其發(fā)生轉化，產(chǎn)生的 iPS 細胞在形態(tài)、基因和蛋白表達、表觀(guān)遺傳修飾狀態(tài)、細胞倍增能力、類(lèi)胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。材料與儀器
器材：① 37 ℃ 水浴鍋② 一次性無(wú)菌培養皿③ 一次性無(wú)菌移液管④ T75 培養瓶⑤ 涂有明膠的 6 孔板⑥ 15 ml 離心管、注射器和針頭試劑：
① 材料：提前制備好的飼養層細胞② DMEM 培養基③ 胎牛血清④ 谷酰胺⑤ 非必需氨基酸⑥ DF12 培養基
⑦ 血清替代物⑧ 谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液⑨ b-FGF 溶液⑩ β-巰基乙醇步驟
多潛能干細胞的誘導的基本過(guò)程可分為如下幾步：（一）試劑配制
（1）MEF 培養基的配制 DMEM 培養基，450 ml；胎牛血清（56 ℃ 熱滅活 30 min），50 ml；200 mmol/L-谷酰胺，5 ml；非必需氨基酸，5 ml。將所有組分混合后，用 0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌，4 ℃ 保存，保持無(wú)菌。（2）胚胎干細胞培養基的配制 DF12 培養基，200 ml；血清替代物，50 ml；200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液，1.25 ml；非必需氨基酸 100x 溶液，2.5 ml；b-FGF 溶液，5 ml。所有組分都加入 250 ml 培養瓶中，用 0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌。培養基最好在 2 周內使用。
（3）200 mmol/L-谷酰胺＋2-巰基乙酉享溶液的配制。200 mmol/L-谷酰胺（使用前冷凍保存），5 ml；β-巰基乙醇，7 μl?；靹?。（4）b-FGF 的配制。b-FGF，10 μg；0.1％ BSA 無(wú)菌，5 ml。溶解后按 0.5 ml 每份分裝，冷凍保存。（二）開(kāi)始前準備
（1）小鼠胚胎成纖維細胞的獲得 通過(guò)同源重的方法將雙選擇標記系統，如βgeo（neo 用于 G418 篩選，βGal 用于顯影）基因盒，同源重組到小鼠 Nanog 基因位點(diǎn)，使βgeo 受內源性 Nanog/O）ct 啟動(dòng)子控制，由于 Nanog 只在 ESC 中表達，所以來(lái)源于 Fbx 158geo / 3gco 小鼠的體細胞由于缺乏 ES 特性，不能在 G418 中生長(cháng)。按 MEF 制備方法，從 Fbx15βgeo/βgco 小鼠中分離培養 Fbx15βgea/βgeo 來(lái)源的 MEF。（2）經(jīng)典的「Yamanaka」法 OCT4，SOX2，KLF4，C-MYC 病毒的準備。（3）MEF 飼養層細胞的制備。（三）細胞誘導
（1）感染前一天，將處于對數生長(cháng)期的 Fbx15 Pgco/βgeo 來(lái)源的 MEF 細胞鋪于 6 孔培養板，使感染時(shí)細胞達到 80％ 的匯合。（2）按測定的病毒滴度，以 10 個(gè) pfμ/細胞加入適量濃縮病毒上清，用 MEF 培養基補齊至每個(gè)孔 2.5 ml 體積，再加入終濃度為 8 μg/ml 的 polybrene（聚凝胺），混合均勻。（3）棄去 Fbx15 βgeo/βgco 來(lái)源的 MEF 細胞的培養上清液，加入上步制備的病毒溶液，6 孔培養板每孔加 2.5 ml 的病毒溶液。37 ℃ 孵育 4 h 到過(guò)夜。
（4）換新鮮胚胎干細胞培養基。（5）感染后 3 d，向培養基中添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418。（6）每 2～3 天換新鮮胚胎干細胞培養基，添加終濃度為 0.3 mg/ml 的 G418，進(jìn)行克隆篩選，持續 2～3 周。（7）在培養過(guò)程中，觀(guān)察克隆形成情況。將其中與 ES 細胞形狀相似克隆按 ESC 培養方法擴增傳代，并進(jìn)行鑒定。（四）實(shí)驗結果及分析
誘導成功的 iPS 需進(jìn)行多能性的鑒定，鑒定的內容包括以下幾方面。（1）形態(tài)學(xué)標準。（2）生長(cháng)特性。
（3）發(fā)育潛能：2N 囊胚注射，獲得嵌合體病能通過(guò)生殖系遺傳給后代（形成三胚層細胞并能夠形成配子細胞遺傳給下一代）；4N 囊胚注射，通過(guò)此方法獲得的小鼠，胚外組織來(lái)源于 4N 的細胞，而小鼠則全部來(lái)自 iPS 細胞。（4）標志分子表達。（5）表觀(guān)遺傳學(xué)特性。注意事項
（1）目前已經(jīng)報道的轉錄因子的組合有很多，在 Yamanaka 四因子基礎上，還報道的組合有 OCT4，SOX2，NANOG 和 LIN28；OCT4，SOX2 和 KLF4；Sox2，c-Myc 和 Klf4；使用前冷凍保存。按 50 ml 分裝后冷凍保存，使用前融化。（2）目前用于過(guò)表達上述核心轉錄因子的手段有很多，包括反轉錄病毒載體，腺病毒載體，轉染質(zhì)粒，重組蛋白誘導方法，化學(xué)小分子 ［例如 G9a 組蛋白甲基轉移酶的小分子抑制劑 BIX-01294（BIX）］ 等。（3）對于提高誘導效率方面，MSC 作為誘導細胞其誘導成為 iPS 的效率較皮膚來(lái)源成纖維細胞的比率高：組蛋白脫乙?；敢种苿﹥任焖幔╒PA）和新報道的維生素- C 能顯著(zhù)提高 iPS 的誘導比率。（4）陽(yáng)性克隆的篩選方法包括報告基因篩選和形態(tài)學(xué)標準篩選。報告基因篩選方法是指用基因重組技術(shù)建立具有藥物抗性基因的小鼠成纖維細胞抗性受內源性 nanog 或（）ct4 表達調控，通過(guò)壓力篩選，表達耐藥基因的克隆優(yōu)勢生長(cháng)。以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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