材料與儀器

D-PBSA 無(wú)血清角質(zhì)形成細胞培養液 胰蛋白酶 EDTA Biocoat6孔培養板

步驟

一、材料

滅菌

無(wú)血清角質(zhì)形成細胞培養液（keratinocyteserum-freemedium，KGM;Clonetics): 含有 0.15 mmol/LCa2-、0.1ng/ml 人上皮生長(cháng)因子、5ug/ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可-的松和 30ug/ml 牛垂體提取物。

EMEM(Eagle'sminimalessentialmedium)

D-PBSA：不含 Ca2+和 Mg2+的 DulbeccoPBSA 液 FBS

胰蛋白酶和 EDTA 混合液：0.05% 胰蛋白酶，0.5 mmol/L EDTA
纖連蛋白和膠原蛋白混合液（fibronectin/collagen，FNC)：10ug/ml 纖連蛋白、35ug/ml 膠原蛋白和 lOOug/mlBSA。BSA 作為穩定劑

Biocoat 6 孔培養板：涂有鼠尾 I 型膠原蛋白（B-D Biosciences)

二、操作步驟 

原代培養 

1. 將供體角膜放于消毒過(guò)的物品上，上皮面朝上，用手術(shù)刀切成 12 個(gè)三角形組織片。應一刀切下去，避免鋸割。如此仔細處理角膜可減少對膠原蛋白基質(zhì)的破壞和成纖維細胞的脫落。

2. 將角膜組織片的上皮面翻向下，放入用鼠尾 I 型膠原蛋白預涂的 6 孔培養板，每孔放 4 個(gè)組織塊。

3. 用鑷子輕壓組織片，以便使組織塊與培養皿表面充分接觸。將組織片放置 20 min，使其變干。

4. 將一滴 KGM 輕輕滴于組織片上，在 37°C 和 5%CO2 條件下孵育過(guò)夜。盡管從眼庫得到的供體角膜是用含有抗菌素的培養液（McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的，但全部操作應在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

5. 第 2 天，在培養皿中加人 lml 培養液。在培養早期，可觀(guān)察到細胞僅從角膜緣處遷出，但沒(méi)有細胞從角膜中央部或鞏膜遷出。無(wú)血清培養液含有低濃度鈣（0.15 mmol/L)，減少膠原蛋白基質(zhì)降解，故這種培養液可減少成纖維細胞長(cháng)出。

6 在植入角膜組織片后第 5 天，用鑷子將組織片取出，再加人 3 ml 培養液。取出組織片后，貼壁細胞繼續增殖。培養后第 2 周，細胞生長(cháng)形成單層，呈現上皮具有的典型卵石狀排列特征。每個(gè)角膜約獲得 1X106?5X106 個(gè)上皮細胞。

擴增培養

7. 取出組織片后，每周換液 2 次。

8 當細胞匯合達 70%?80% 時(shí)，用 D-PBSA 浸洗細胞。然后，在 37°C 條件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理 4 min。

9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 終止消化。

10 將細胞離心后，用 KGM 混懸。計數細胞，以 1X104 個(gè)/cm2 密度將細胞接種于涂有 FNC 的培養皿。

11 在 37°C、95% 空氣和 5%CO2 條件下培養。

12. 胰蛋白酶處理和種植 1d 后換培養液。

傳代后不久，上皮細胞呈長(cháng)梭形，折光，遷移能力較強。傳代后第 1 周，細胞匯合達 70%?80% 時(shí)呈卵石狀排列。如果形成單層后繼續培養，細胞能生長(cháng)成散在的復層結構。

盡管角膜上皮細胞能傳至 5 代，約倍增 9?10 倍，但大多數細胞增殖發(fā)生在第 1?3 代。每個(gè)角膜約獲得 1X106?2X106 個(gè)上皮細胞。細胞常在第 5 代開(kāi)始衰老。