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人胚胎干細胞傳代培養
發(fā)布時(shí)間： 2023-01-12 點(diǎn)擊次數： 779次簡(jiǎn)介
胚胎干細胞是具有一種具有自我更新和全能分化能力的細胞，能發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調控機制理想的模型，也是用于人類(lèi)疾病的干細胞治療和器官組織移植理-想的種子細胞。建立新的人類(lèi)胚胎干細胞系仍然有很大的倫理學(xué)爭議，目前對人胚胎干細胞的研究主要就是基于已經(jīng)建立的人胚胎干細胞系的研究。
原理
人胚胎干細胞傳代培養的原理是人胚胎干細胞快速生長(cháng)和擴增，而細胞培養箱恰恰能提供培養所需的環(huán)境。
用途
胚胎干細胞常用于發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調控機制理想的模型，也是用于人類(lèi)疾病的干細胞治療和器官組織移植理-想的種子細胞。
材料與儀器
器材：①37 ℃ 水浴鍋②一次性無(wú)菌培養皿③一次性無(wú)菌移液管④T75培養瓶⑤15 mL 離心管、注射器和針頭⑥涂有明膠的6 孔 板試劑：①材料：提前制備好的飼養層細胞②95％乙醇步驟
人胚胎干細胞傳代培養的基本過(guò)程可分為如下幾步：（一）試劑配制
（1）膠原酶溶液的配制使用濃度1 mg ／mL 。膠原酶，30mg；DF12培養基，30 mL 。使膠原酶充分溶解于DF12基礎培養基。用0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌。（2）胚胎干細胞培養基的配制DF12培養基，200 mL ；血清替代物50 mL ；200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液，1.25 mL ；非必需氨基酸100x溶液，2.5 mL ；b-FGF 溶液，5 mL 。所有組分都加入250ml培養瓶中，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌。培養基最好在2周內使用。（3）200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液的配制200 mmol ／L -谷酰胺，5 mL ；2-巰-基-乙-醇，7 μl ，混勻。
（4）b-FGF的配制b-FGF，10 μg ；0.1％BSA無(wú)菌，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分裝冷凍保存。（二）確定傳代時(shí)機
通常以下情況時(shí)，胚胎干細胞需要傳代①小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）飼養層超過(guò)2 周 。②胚胎干細胞的克隆密度太高或克隆大小太大。③胚胎干細胞克隆出現分化現象。（三）膠原酶處理
（1）需要傳代時(shí)，將胚胎干細胞培養板從培養箱取出，吸去培養上清。（2）6 孔板培養時(shí)，每個(gè)孔加1 mL 膠原酶溶液。（3）處理至少5 min 。（4）倒置顯微鏡下觀(guān)察，直至細胞克隆從培養板表面脫離。注意：可以看到克隆周邊會(huì )出現皺褶。根據消化情況，膠原酶處理時(shí)間可再延長(cháng)6～10 min 。（四）刮細胞
（1）用5 mL 玻璃移液管，將細胞從培養板表面刮下來(lái)。（2）同時(shí)輕輕吹打膠原酶溶液，使細胞從培養板上面完-全脫離。（3）所有細胞團都留在培養板中，直到整個(gè)6 孔 板都按步驟（1）、（2）處理完。
注意：這些步驟可以直視下完成，也可以在解剖纖維鏡下完成。
（五）收集并打散克隆
（1）將整塊6 孔 板的細胞都轉移到一個(gè)15 mL 離心管中。（2）每個(gè)孔加1 mL 胚胎干細胞培養基沖洗，并將沖洗液也轉移到細胞懸液中。（3）在15 mL 離心管中，輕輕吹打細胞懸液數分鐘，進(jìn)一步打散細胞克隆。注意：吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。（六）離心傳代
（1）將打散的細胞克隆，200 g 離心5 min 。（2）去除上清液。（3）輕輕拍散細胞團，加2～3 mL 胚胎干細胞培養基重懸細胞，輕輕混勻。（4）200 g 離心5 min 。（5）胚胎干細胞離心同時(shí)，將提前準備好的飼養層培養板取出，吸棄MEF培養基。（6）用6 孔 板培養的飼養層，每個(gè)孔加1 mL PBS，輕輕晃動(dòng)，洗去培養基中所含的血清。
注意：PBS處理成纖維細胞的時(shí)間不要超過(guò)6～10 min 。
（7）胚胎干細胞離心結束后，棄去上清液，輕輕拍散細胞團。（8）加入2～3 mL 胚胎干細胞培養基，重懸細胞。（9）再加入足夠的胚胎干細胞培養基，使6 孔 板的每個(gè)孔細胞懸液體積為2.5 mL 。（10）去除飼養層培養板中的PBS，每個(gè)孔加入2.5 mL 細胞懸液，用移液管輕輕混勻。
（11）在水平臺面上，短促地上下左右地晃動(dòng)培養板，使加入的胚胎干細胞均勻分布到飼養層上。
（12）將培養的胚胎干細胞放入培養箱，使克隆重新貼壁。注意：在重新貼壁的這段時(shí)間內，要盡量少開(kāi)關(guān)培養箱，維持培養環(huán)境的穩定，以利于胚胎干細胞重新貼壁。
（13）每天更換新鮮培養基。注意觀(guān)察克隆生長(cháng)狀態(tài)，在需要時(shí)按上述步驟再次傳代。（七）凍存
（1）按上述步驟收集胚胎干細胞細胞懸液，200 g 離心5 min 。（2）配好的凍存液（90％胎牛血清，10％DMSO）置于冰上備用。（3）棄去上清液，將細胞團排松散后用凍存液重懸，逐滴加入凍存液，混勻。一般一個(gè)6 孔 培養板凍6 支 ，重懸時(shí)每個(gè)培養板的細胞加6 mL 凍存液。（4）迅速將1 mL 細胞懸液裝入1.5 mL 凍存管。蓋緊后放入異丙醇凍存盒中。（5）將凍存盒降至室溫后，轉入-80 ℃ 冰箱，保存過(guò)夜。（6）次日將凍存的細胞轉入液氮罐保存。注意：人胚胎干細胞凍存前不能將細胞消化成單細胞，消化后的細胞團塊稍大為好。（八）復蘇
（1）將凍存的胚胎干細胞從液氮中取出，浸入37 ℃ 水浴，輕輕轉動(dòng)，注意凍存管蓋不要沒(méi)入水中。（2）當只剩一個(gè)小冰晶時(shí)，將凍存管從水浴中取出。（3）將凍存管浸入95％乙醇浴消毒，在無(wú)菌超凈臺中晾干。（4）將細胞從凍存管中轉入15 mL 離心管中，逐滴加入4 mL 胚胎干細胞培養基，輕輕混勻。（5）200 g 離心5 min ，去除凍存液。（6）去除上清液，將細胞團輕輕拍散，加2.5 mL 胚胎干細胞培養基重懸細胞。（7）將細胞懸液轉移到鋪有照射后的飼養層細胞的6 孔 板中。每孔加2.5 mL 細胞懸液。飼養層細胞提前用1 mL PBS洗一遍，去除血清。（8）放入培養箱，第二 天 將細胞上面漂浮的死細胞吸去并換液，按常規方法繼續培養。（9）每天觀(guān)察細胞密度。按需傳代。注意事項
（1）所有試劑都應記錄保質(zhì)期和批號，小包裝分裝保存，避免反復凍存。培養基配制后最好在2 周 內用完。（2）胚胎干細胞克隆的消化液可有多種選擇，除了上文介紹的膠原酶消化，也可用0.05％的胰蛋白酶消化，消化時(shí)間比膠原酶消化所需時(shí)間要短，一般1～2 min ，待克隆周邊有皺褶時(shí)，要加用MEF培養基中止胰蛋白酶作用，其他步驟基本一致。（3）用消化傳代的時(shí)候務(wù)必不能將人胚胎干細胞消化成單個(gè)細胞，否則克隆形成率很低。（4）傳代時(shí)細胞密度很重要，人胚胎干細胞一般的傳代比例是1:5～1:10。接種的細胞太少不易生長(cháng)，最好4～6 d 傳代一次。（5）人胚胎干細胞對營(yíng)養要求很高，因此必須每天換液，細胞一般培養在6 孔 皿中。（6）一般使用第2～4 代 的小鼠成纖維細胞（MEF）作為飼養層細胞。細胞接種到培養皿后一般在3 d 內使用，放置時(shí)間過(guò)長(cháng)的飼養層細胞不利于人胚胎干細胞生長(cháng)。（7）人胚胎干細胞的培養環(huán)境是37 ℃ ，飽和濕度，5％CO2。培養箱應當每月清洗和衡一次，最好不要在同一培養箱內再培養其他種類(lèi)的細胞，以免交叉污染。
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