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Feulgen反應顯示細胞中DNA

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-13　　點(diǎn)擊次數： 1409次

簡(jiǎn)介
Feulgen反應由Feulgen在1924年發(fā)明，是一種傳統的、也是最為經(jīng)典的通過(guò)化學(xué)染色來(lái)特異性顯示細胞中DNA的方法。
原理
Feulgen反應顯示細胞中DNA的基本原理是首先采用稀酸作用于DNA，使其脫去嘌呤堿，暴露出游離醛基，該醛基與Schiff試劑反應生成紫紅色產(chǎn)物，細胞中存在有DNA的部位即呈現紫紅色陽(yáng)性反應。如圖3-1中所示，堿性品紅是紅色物質(zhì)，能與產(chǎn)生SO2的試劑作用形成無(wú)色產(chǎn)物，即Schiff試劑，它可以與DNA水解釋放出的醛基結合而氧化為紫紅色化合物。
用途
Feulgen 反應顯示細胞中 DNA 既可檢測細胞或組織中 DNA 的存在部位及分布，也可利用其顯色強度與 DNA 含量成正比的特性，用于對細胞或組織中的 DNA 含量進(jìn)行測定。由于反應對含有 DNA 的核結構顯示細致、清晰，染色穩定，有利于鑒別不同核結構和分化程度的細胞，如白血病細胞等。
材料與儀器
器材：
尖頭鑷子、染色缸、蓋片、載玻片、吸管、吸水濾紙、普通光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、CO2培養箱、HeLa人宮頸癌上皮細胞。
試劑：
①Hanks液

（1）原液甲NaCl 160 g ，KC18 g ，MgSO4•7H2O2 g ；MgCl2•6H2O2 g ，溶于800 mL 蒸餾水中。CaCl2（無(wú)水）2.8 g ，溶于100 mL 蒸餾水中。將兩種液體混合后，加水至1000 mL ，用濾紙濾過(guò)，再加2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用。
（2）原液乙 Na2HPO4•12H2O3.04 g ，KH2PO41.2 g ，葡萄糖20.0 g ，溶于800 mL 蒸餾水中，用濾紙過(guò)濾，然后加0.5％酚紅80 mL ，再加水至1000 mL ，最后加入2 mL 氯仿防腐，置4 ℃ 冰箱備用。
（3）使用液甲乙兩液各1 份，雙蒸水18 份，混勻分裝，經(jīng)101 bf ／in （68.9 kPa ）15 min 高壓滅菌后置4 ℃ 冰箱中保存。臨用前用無(wú)菌的5.6％NaHCO3 調至所需 pH 值。）
②1 mol ／L 鹽酸
③Schiff 試劑
（堿性品紅0.5 g 加入100 mL 煮沸的蒸餾水中，持續煮沸5 min ，并隨時(shí)攪拌，使之充分溶解。然后將其冷卻到50 ℃ ，過(guò)濾到棕色瓶中，加1 mol ／L HC110 mL ，冷卻至25 ℃ 時(shí)加入1 g 無(wú)水亞硫酸氫鈉（NaHSO3），需充分振蕩后，避光過(guò)夜。次日取出（呈淡黃色），加0.25 g 活性炭劇烈振蕩1 min ，過(guò)濾后即得 Schiff 試劑，此時(shí)溶液應完-全無(wú)色。避光、低溫、密封保存。用前應事先取出使其恢復至室溫。）
④ Carnoy 固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1）
⑤0.5％亮綠
⑥蒸餾水
⑦70％乙醇
⑧80％乙醇
⑨95％乙醇

⑩無(wú)水乙醇
?二甲苯
?中性樹(shù)膠
步驟
Feulgen 反應顯示細胞中 DNA 的基本過(guò)程可分為如下幾步：
A.將培養的 HeLa 細胞接種于蓋片，24～48 h 后生長(cháng)為單層。
B.取細胞蓋片1 張，用 Hanks 液（pH 7.2～7.4）漂洗3 次，吸水濾紙吸干液體。
C.放入 Carnoy 固定液中固定30 min 。
D.蒸餾水洗3 次。
E.將蓋片置于1 mol ／L 鹽酸中，60 ℃ 水浴水解10 min 。
F.蒸餾水洗1 次。
G.將蓋片移入 Schiff 試劑中，暗處反應30 min 。
H.流水沖洗5 min 。
I.蒸餾水洗3 次。
J.0.5％亮綠復染1～3 min 。
K.70％乙醇→80％乙醇→95％乙醇→無(wú)水乙醇梯度脫水。
L.蓋片浸入二甲苯中透明5 min 。
M.滴1 滴中性樹(shù)膠于載玻片上，將蓋片細胞面朝下封片。
N.鏡下觀(guān)察。
注意事項
1.本實(shí)驗的關(guān)鍵步驟是有效地控制DNA水解的程度，包括稀酸的濃度，水解的時(shí)間、溫度等。水解不足，會(huì )使游離醛基的暴露不完-全，反應變弱；水解過(guò)度，會(huì )導致 DNA 異常降解，也同樣使反應變弱，染色深度下降，嚴重時(shí)出現陰性反應。一般的水解時(shí)間應控制在10～15 min ，同時(shí)應考慮不同標本材料的影響。
2. Schiff 試劑的質(zhì)量也是影響實(shí)驗結果的重要因素，試劑暴露于空氣中易被氧化而變成紅色，使試劑失效。操作及保存中不宜過(guò)多暴露于空氣，并應注意避光。
3.本實(shí)驗采用蓋片培養細胞，因此在整個(gè)操作過(guò)程中，應注明蓋片的正反面，防止破壞細胞面，尤其在進(jìn)行流水沖洗步驟時(shí)，應避免水流直接接觸細胞面。

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