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消滅 PCR 非特異性擴增的方法
發(fā)布時(shí)間: 2023-06-28 點(diǎn)擊次數: 952次非特異性擴增,即進(jìn)行 PCR 所擴增出來(lái)的條帶不是所要的,引物與模板在非目的條帶處有錯配,導致延伸產(chǎn)物不是目的條帶。例如引物二聚體,即引物在退火過(guò)程中產(chǎn)生了 hairpin 結構或其他二級結構,或者引物在模板的某些位置非特異性地結合,也同樣會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增。PCR 產(chǎn)物都是通過(guò)引物延伸產(chǎn)生的。當引物產(chǎn)生了二聚體或者非特異性擴增產(chǎn)物之后,引物本身就無(wú)法再延伸形成 PCR 產(chǎn)物了,這樣的情況下,非特異性擴增產(chǎn)物越是多,那目的產(chǎn)物就越是少。如果在 qPCR 過(guò)程中,就會(huì )在熔解曲線(xiàn)中形成雙峰。
消滅 PCR 非特異性擴增的方法:1、引物設計的過(guò)程中要用 Primer premier 5.0 來(lái)驗證一下二聚體;
2、 引物合成后,先做一次梯度 PCR,檢測最合適的退火溫度,一般高退火溫度可以提高引 物對模板的特異性從而降低引物二聚體;
3、 降低 Mg2+濃度,鎂離子濃度高,會(huì )導致大量的非特異性擴增,但是沒(méi)有鎂離子的話(huà),也會(huì )導致 Taq 酶的失活;
4、降低 dNTP 濃度,dNTP 也是非特異性擴增的一個(gè)罪魁禍首,降低它的濃度,也能有效降低二聚體及其他非特異性擴增;
5、降低引物濃度,一般的 PCR 引物都是過(guò)量的,降低了引物濃度自然也能降低引物之間形成二級結構的可能性;
6、提高退火溫度,這個(gè)道理很簡(jiǎn)單,引物的退火溫度提高,引物間的二級結構形成可能性就會(huì )降低;
7、延長(cháng)退火時(shí)間,這個(gè)也可以減弱引物間結合的可能性;
8、DMSO 及甜菜堿,這些 PCR 促進(jìn)劑,主要是用于 CG 含量高的模板上,降低 DNA 的二級結構的產(chǎn)生,但根據經(jīng)驗,加入 DMSO 之后需要同時(shí)提高一點(diǎn)退火溫度來(lái)補平(qPCR 不太適用);
9、熱啟動(dòng)法,通過(guò) 95℃的高溫熱啟動(dòng),高溫解鏈,使得引物間的二級結構破壞,以此降低二聚體產(chǎn)生。深圳安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、壹流的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)??偛吭O在廣東,服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司,旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供壹流的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn),在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供世界前沿水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品,安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等優(yōu)質(zhì)客戶(hù)提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。
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