二、線(xiàn)性化載體

三、純化PCR、酶切產(chǎn)物并連接

將反應結束的產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好，目前有多種試劑盒可供選擇；

連接線(xiàn)性化載體和PCR產(chǎn)物，可根據DNA連接酶試劑盒說(shuō)明書(shū)設置，對于較大的片段可以選擇4℃連接過(guò)夜。

四、細菌轉化

冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（DH5α）；取重組產(chǎn)物，加至感受態(tài)細胞中，冰上靜置30min，42℃水浴熱激45s，迅速置于冰上2-3min；加入600μL LB液體培養基,37℃搖菌1h。

PCR正常反應結束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，選擇正確條帶的菌液加入對應的培養基，37℃搖起來(lái)。

注意事項：

②菌落PCR反應程序變性94℃4-5min即可保證外源DNA釋放出來(lái)。

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