簡(jiǎn)介：

首先，如果你已經(jīng)設計了引物，PCR擴增沒(méi)有條帶，請這樣做：

使用第一次的PCR產(chǎn)物作為模版（1~2ul即可），再進(jìn)行一次PCR。

那你要重新學(xué)習PCR擴增了！這篇內容，涵蓋了實(shí)驗中可能遇到的PCR擴增問(wèn)題和詳細的解決辦法，主要是如何培養問(wèn)題解決問(wèn)題的思考能力，你必須要知道！

PCR擴增主要包括以下幾個(gè)組分：1）引物；2）酶；3）dNTP;4)Buffer;5)CDNA或DNA。注：現今大部分PCR酶試劑盒一般都是酶，dNTP和Buffer的預混液。

因此，需要從引物，酶，cDNA和DNA模版下手，進(jìn)行分析。

一共有以下三步：

第一步，一定要確定的是-cDNA。

每個(gè)基因在不同組織，不同時(shí)期中表達量是不同的。首先要確定你的基因在哪個(gè)組織，哪個(gè)時(shí)期表達最高，確認之后就選這些組織和時(shí)期，否則很難做出來(lái)。

問(wèn)題：怎么查找目的基因在哪個(gè)組織和時(shí)期中表達高？

答：1）數據庫。例如NCBI數據庫。

2）文章。查詢(xún)你目的基因的別人做過(guò)的文章，看看他們使用的什么。

3）新的基因，沒(méi)有數據庫記載，沒(méi)有報道，什么都不知道。使用幾種組織的混合的cDNA.

第二步：檢查你的酶

酶的品質(zhì)（主要是公司的工藝好不好），活性，保質(zhì)期，buffer的凍融程度都會(huì )很大程度影響PCR擴增。因此，換一個(gè)酶是相對簡(jiǎn)單，必須試用的方法。

第三步：最需要實(shí)驗經(jīng)驗-引物設計

解決了酶和cDNA的問(wèn)題之后，需要進(jìn)行最復雜的引物設計。引物設計是靈活的，根據目的的不同而不同。qPCR引物設計因為可以在序列上隨機選擇,因此可以使用引物設計引物進(jìn)行設計，在這里我們主要詳解基因克隆的引物設計，一般包括CDS的設計，基因區的設計，非編碼區的設計等，這些片段的引物設計一般都固定在一段序列上，不能隨意更改（GC含量，TM值都只能固定在一個(gè)相對范圍內），因此需要一定的實(shí)驗經(jīng)驗和理論基礎，以下為詳細的解決方法。

1.GC含量低于40%或高于60%,長(cháng)度不在18-25范圍內，會(huì )出現引物二聚體，設計的引物不能遵循引物設計的原則怎么辦？

答：不是所有的引物都必須遵循引物設計的原則，也不是所有遵循引物設計設計原則的都可以擴增出來(lái)。例如：GC含量為65%，長(cháng)度為28，如果實(shí)在設計不了符合原則的，可以以相對符合的設計方式進(jìn)行，不必全部符合。

2.設計了好幾組引物，都不能擴增出來(lái)，怎么辦？

酶和cDNA都確定好之后，引物仍然擴不出來(lái)條帶，對于不同的目的可以使用不同的方法。

①對于鑒定目的基因，只是想要確定這個(gè)基因的序列，可以這樣做：

在引物兩端加一段堿基（5‘的序列可以自己設計），改變引物的GC含量，TM值等。

②對于僅需要擴增目的基因，不能在5’端添加堿基的情況，且使用F2/R2不能擴增出條帶，可以這樣做：

先在CDS兩端設計一對引物，先使用F1/R1進(jìn)行擴增。然后再使用CDS引物F2/R2進(jìn)行擴增。

③對于表達載體，需要擴增到載體上，可以這樣做：

1）先設計CDS區的引物F2/R2擴增，再使用這個(gè)PCR產(chǎn)物作為模版，使用帶酶切位點(diǎn)（藍色為酶切位點(diǎn)及保護堿基序列）的引物F1/R1進(jìn)行擴增。

2）改變所用的酶切位點(diǎn)。

3）換連接方法。如果使用T4連接，可以換成同源重組的方法。

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