轉染是實(shí)驗過(guò)程中常用的技術(shù)操作，通俗來(lái)說(shuō)，常見(jiàn)的轉染即為把某種功能性質(zhì)粒轉到細胞中去，通過(guò)轉染試劑的作用在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，收集細胞通過(guò)WB、qpcr等來(lái)檢測質(zhì)粒是否正常發(fā)揮作用來(lái)達到我們實(shí)驗的某種需求；不同的質(zhì)粒通常有不同的轉染試劑和不同的方法，如PEI轉染、lipo2000轉染等。

Lipofectmine ™ RNAiMAX轉染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 雙鏈體轉染使用，具有轉染效率高、對細胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)，分為正向轉染及反向轉染兩種方式。siRNA轉染比較常見(jiàn)，因此本文分享主要針對siRNA反向轉染。

轉染前準備

1.準備試劑包括：Opti-MEM培養基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA、不加雙抗的10%FBS培養基、胰酶、PBS緩沖液等常見(jiàn)處理細胞的試劑。

2.反向轉染要求細胞密度≥90%。

轉染中

1.按正常處理細胞的流程將長(cháng)滿(mǎn)的細胞經(jīng)過(guò)胰酶消化離心后去上清，注意此處需要加無(wú)雙抗的10%FBS培養基1ml進(jìn)行細胞重懸，重懸完后根據細胞生長(cháng)速度鋪細胞，保證轉染完后24h細胞密度達到30-50%。

2.轉染復合物制備：根據說(shuō)明書(shū)制備轉染復合物，添加量如下表所示。

根據轉染的實(shí)際情況將Opti-MEM培養基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA依次加入到一個(gè)無(wú)菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培養基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX試劑的順序，輕輕混勻室溫孵育20min。

3.20min后依次將轉染復合物加入細胞培養皿種，輕輕混勻，放入細胞培養箱內。

轉染后

1.轉染后24h內最好不要挪動(dòng)細胞，也不要拿出在顯微鏡下觀(guān)察，期間也無(wú)需進(jìn)行細胞換液。

2.轉染后48h后，可拿出細胞觀(guān)察細胞形態(tài)有無(wú)變圓，肉眼觀(guān)察轉染效率，對于生長(cháng)較慢的細胞，其表型可能會(huì )在72h內逐漸顯現。根據細胞生長(cháng)情況可進(jìn)行換液，注意此時(shí)需要換含雙抗的血清培養基。

3.在顯微鏡下觀(guān)察細胞形態(tài)，若細胞變圓較為厲害，應在轉染后4天左右收細胞進(jìn)行轉染效率測定，時(shí)間太久細胞太少的話(huà)檢測難度較大。

4.此種轉染方式最長(cháng)可維持5-7天的基因敲除效果。

注意事項

1. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑在冰箱4℃保存，切記不能冷凍。

2. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑不宜在室溫放置過(guò)久，因此在制備轉染復合物前從冰箱拿出，加完后應立即放回4℃再進(jìn)行后續操作。

3.轉染復合物制備完成后室溫孵育時(shí)間不得超過(guò)20min，因此建議將細胞鋪好板后十字混勻，暫放于細胞培養箱內，再進(jìn)行轉染復合物的制備。

4.siRNA應于-80℃保存。

5.在處理細胞重懸時(shí)一定要使用無(wú)雙抗的10%FBS培養基，避免細胞死亡，如果在鋪板后還要進(jìn)行細胞傳代也沒(méi)有影響，直接用上述混懸液傳代即可。

6. Lipofectamine ™ RNAiMAX轉染的兩種方式差別不是很大，主要區別在于正向轉染需要提前一天進(jìn)行細胞鋪板，第二天直接加入轉染復合物，同時(shí)還需要在轉染后4-6h進(jìn)行細胞換液。反向轉染速度比正向轉染更快，操作較為簡(jiǎn)潔，因此更建議使用反向轉染。

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