細胞轉染前的準備：

1.細胞：

貼壁生長(cháng)細胞：一般要求在轉染前一日，必須用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，轉染當日的細胞密度以70%-90%（貼壁細胞），最好在轉染前2-4h換一次新鮮培養液。

懸浮細胞：轉染前12-16h進(jìn)行懸浮細胞傳代，傳代后適宜的細胞密度為20-40x10⁴/mL。臺盼藍染色進(jìn)行活細胞計數保持活細胞比在95%以上。

提前將293F細胞的密度調整至合適的密度后（2×106 - 4×106細胞/ml）于37°C搖床培養2-4h后進(jìn)行轉染。注意，參與轉染的細胞必須是培養三代或以上的穩定細胞株。

2.DNA：使用去內毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，于生物安全柜/超凈臺用0.22um濾頭過(guò)濾除菌。

3.稀釋液：于生物安全柜/超凈臺用0.22 μm濾頭過(guò)濾除菌。

4、轉染試劑：轉染試劑如PEI溶液長(cháng)期儲存于- 20℃，不可反復凍融，溶液在4℃放置不超過(guò)一周。

操作步驟（懸浮細胞）：

1、取一支已滅菌的Ep管，加入一定量的DNA，以相應體積的300 mM NaCl稀釋?zhuān)脴岊^混勻后靜置5 min；

另取一支已滅菌的Ep管，加入相應體積的300 mM NaCl稀釋對應體積的PEI溶液用槍頭混勻后靜置5 min（稀釋液與DNA、PEI的總體積應為轉染體積的5%）。

將質(zhì)粒和PEI溶液混合，槍頭混勻后靜置一段時(shí)間，使DNA與PEI形成穩定的聚合物。

2、從搖床中取出293F細胞。用1 mL移液槍滴緩慢滴加轉染混合液，邊加邊搖晃搖瓶使轉染更加充分。

3、轉染后將懸浮細胞置于搖床中培養，條件為37℃、8%CO2、110 rpm。每隔24 h進(jìn)行細胞計數并用臺盼藍染色液觀(guān)察細胞的存活率。

注意事項：

1、DNA純度：使用去內毒素的質(zhì)粒大提試劑盒，細菌產(chǎn)生的內毒素對細胞狀態(tài)有很大的影響。

用于轉染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染，確保質(zhì)粒OD值A260/A280在1.8~2.0之間。

提完質(zhì)粒后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗驗證DNA的純度，通常情況下DNA為超螺旋狀態(tài)（此狀態(tài)下轉染效率更高）。

2、優(yōu)化條件

質(zhì)粒不同，所轉染的細胞不同及定量的準確性等因素會(huì )導致在一些情況下轉染效率低，蛋白表達量低，基于這種情況需要對質(zhì)粒轉染試劑的配比、DNA的濃度、質(zhì)粒與轉染試劑的聚合時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

3、轉染的稀釋液

研究報道，300 mM NaCl溶液稀釋DNA和轉染試劑轉染效率比普通培養基高。

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