前置知識

通過(guò)病毒介導將核酸導入哺乳動(dòng)物細胞是一種常用的實(shí)驗技術(shù)，被廣泛用于基因傳遞、基因表達和功能研究等領(lǐng)域。這個(gè)實(shí)驗通常分為以下6個(gè)部分：

1.選擇適當的病毒載體：常用的病毒載體包括腺病毒（Adenovirus）、腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆轉錄病毒（Retrovirus）。

2. 構建表達載體：將目標核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒載體的適當位點(diǎn)上，構建表達載體。這通常涉及將目標核酸序列克隆到適當的表達載體質(zhì)粒中，并進(jìn)行驗證和測序。

3. 病毒包裝和擴增：將構建好的表達載體轉染到特定的包裝細胞中，這些細胞能夠產(chǎn)生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆?？梢酝ㄟ^(guò)細胞培養和病毒擴增過(guò)程進(jìn)行大規模生產(chǎn)。

4.細胞轉染：將目標哺乳動(dòng)物細胞培養在培養皿或培養板中，然后將病毒顆粒加入培養基中與細胞進(jìn)行共培養。病毒顆粒會(huì )與細胞表面的受體結合，并進(jìn)入細胞內部。

5.核酸導入和表達：一旦病毒進(jìn)入細胞內部，它會(huì )釋放出核酸負鏈，該負鏈會(huì )被細胞核內的轉錄和翻譯機制利用。目標核酸的表達產(chǎn)物（例如蛋白質(zhì)）會(huì )在細胞內合成，并根據實(shí)驗需要發(fā)揮其功能。

6.實(shí)驗分析：根據實(shí)驗目的，可以對細胞和表達產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分析。這可能包括檢測蛋白質(zhì)表達水平、功能研究、細胞行為觀(guān)察等。

操作步驟

A 慢病毒制備：

1、提前一周復蘇293T細胞，使用10% FBS-DMEM培養基傳代3次以上。

轉染前一天將生長(cháng)狀態(tài)良好的293T細胞用0.25%胰酶消化，得到細胞懸液，計數，然后進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒轉染，稀釋到10個(gè)/mL；

將293T接種到6孔板（每孔接種2 mL），使其密度為40%。

待其生長(cháng)到孔板面積80-90%進(jìn)行轉染。

2、通過(guò)質(zhì)粒大提獲得無(wú)內毒素質(zhì)粒。

3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養基、15μL lipofectamine 2000。

4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三條質(zhì)粒質(zhì)量比為 4:3:1）。

5、將等體積的質(zhì)?；旌衔锛尤氲睫D染試劑混合物中，室溫靜置5min。

6、將隔夜培養的6孔板中培養基小心吸出，替換為新鮮DMEM（血清）細胞培養基。每個(gè)孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復合物。

7、分別在轉染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾或離心去除細胞碎片（短期內可放于4℃保存，長(cháng)期保存于-80℃冰箱，勿反復凍融）。

B 慢病毒感染：

1、提前一周復蘇靶細胞，傳代三次以上保證細胞生長(cháng)狀態(tài)良好。病毒感染前一天將靶細胞傳代到6孔板，使細胞生長(cháng)密度為約20%。

2、待細胞生長(cháng)至孔板面積50-60%時(shí)，加入2ml病毒液，加入polybrene,并補加0.5ml（血清）細胞培養基，恒溫培養24h。

3、用（血清）細胞培養基更換病毒液，恒溫培養24h。

4、加入適量的抗生素篩選，每次換液時(shí)補加抗生素，至靶細胞細胞無(wú)明顯死亡。

注意事項：

1.選擇合適的載體和元件：根據實(shí)驗需要選擇適當的質(zhì)粒載體和啟動(dòng)子，例如CMV啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子等。

2. 細胞狀態(tài)和轉染密度：細胞狀態(tài)好，且處于指數生長(cháng)階段。靶細胞密度不宜過(guò)高或過(guò)低，建議將細胞密度控制在指數期的70-80%；

3. 選擇合適轉染試劑、比例和轉染時(shí)間：選擇適當的轉染試劑，不同類(lèi)型的細胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進(jìn)行轉染；

同時(shí)，還需要對慢病毒質(zhì)粒、DNA和轉染試劑的比例、轉染時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化?？稍诟腥景屑毎麜r(shí)加入適量的聚凝胺提高轉染效率。

4.抗生素濃度：可在轉染前做MTT實(shí)驗探究其工作濃度，選取合適的篩選濃度使轉染的細胞能夠存活并形成穩定的細胞系。

5.篩選時(shí)間：在進(jìn)行穩定轉染實(shí)驗時(shí)，需要進(jìn)行足夠長(cháng)的篩選時(shí)間以檢測出穩定轉染的細胞系，轉染后可通過(guò)WB，流式細胞術(shù)，Dot blot等方法驗證。

6．對照組設置：設置陽(yáng)性和陰性對照以評估轉染效果和篩選是否成功。

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