原代細胞的培養與建系

凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養的細胞稱(chēng)之為原代細胞。細胞的純化或細胞克隆技術(shù)是細胞培養工作的基礎。

原代細胞的取材

人和動(dòng)物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，直接影響細胞的體外培養。

一、取材的基本要求

.1．取材要注意新鮮和保鮮

.2．應嚴格無(wú)菌

.3．防止機械損傷

.4．去除無(wú)用組織和避免干燥

.5．應注意組織類(lèi)型、分化程度、年齡等

.6．作好記錄

二、各類(lèi)組織的取材技術(shù)

皮膚和粘膜的取材

內臟和實(shí)體瘤的取材

血液細胞的取材

骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材

動(dòng)物組織取材

人胚體組織取材

雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材

皮膚和粘膜的取材

主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般 2~4 平方厘米。

內臟和實(shí)體瘤的取材

內臟除消化道外基本是無(wú)菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類(lèi)型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締織。

血液細胞的取材

血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、

淋巴結等）分離細胞，取材時(shí)應注意抗凝。

骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材

嚴格無(wú)菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。

動(dòng)物組織取材

1、鼠胚組織取材

首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸泡在含有 75%酒精的燒杯中，5 分鐘后（注意時(shí)間不能太長(cháng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內，影響組織活力），取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開(kāi)皮膚，用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無(wú)菌解剖器材，采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎。

2、幼鼠胚腎（或肺）取材

幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側：然后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側，然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎。

人胚體組織取材

取材方法與鼠類(lèi)相同

雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材步驟

（1）取孵化至適當胚齡（9~12 天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。

（2）將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用 75%酒精棉球擦干；

（3）經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號鑷子打開(kāi)氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼；

（4）用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚；

（5）用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材。

原代細胞的分離和制作

人或動(dòng)物體內（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁

殖，必須將現有的組織塊充分散開(kāi)，使細胞解離出來(lái)。

一、懸浮細胞的分離方法

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，用簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。

二、實(shí)體組織材料的分離方法

對于實(shí)體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。

（一）機械分散法

方法:特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差,適用于處理纖維成分少

的軟組織。

（二）消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細胞間的橋連結構松動(dòng)，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個(gè)細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長(cháng)。

1．酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶

胰蛋白酶分散原理：胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi)。

影響胰蛋白酶作用的主要因素

細胞類(lèi)型.酶的活力.酶的濃度.溫度.pH .無(wú)機鹽離子.消化時(shí)間

膠原酶（Collagenase）消化法

膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用。

2．非酶消化法（EDTA 消化法）

EDTA 是一種非酶消化物，又稱(chēng)螯合劑或 Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離。

3．消化分離法的操作步驟

剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機械分散

4．消化分離法的注意事項

（1）組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(cháng)，以避免毒性作用。

（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。

三、原代細胞的培養方法

原代細胞的培養也叫初代培養是從供體取得組織細胞在體外進(jìn)行的初次培養，是建立細胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細胞較為接近和最能反映體內生長(cháng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實(shí)驗研究。

（一）組織塊培養法

組織塊培養是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養瓶（或皿）中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著(zhù)于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長(cháng)。

（二）消化培養法

（三）懸浮細胞培養法

對于懸浮生長(cháng)的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養。

（四）器官培養

器官培養是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養，器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用于重點(diǎn)觀(guān)察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節作用。

原代和傳代細胞的培養和維持

原代細胞的培養與維持

原代細胞培養的初次傳代

傳代細胞的傳代培養

傳代細胞的建系和維持

一、原代細胞的培養與維持

(一)原代細胞培養：

1．靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養

2．懸浮細胞的培養

靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養要求

細胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；

細胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為 5×108 細胞/L；

培養基可用 Eagle(MEM)或 DNEM 培養；

小牛血清濃度為 10%-80%；

應在 37℃5% CO2 的培養箱中培養；

在起始的 2 天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂??；

待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，應將原代細胞換液；

用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養 1 周時(shí)，應將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液；

懸浮細胞的培養要求原代培養時(shí)要盡量去除紅細胞；

短期培養，可在含 10%小牛血清的 RPMI1640 培養基中進(jìn)行；

細胞濃度可在 5-8×109/L 范圍內，.進(jìn)行分瓶試驗；

長(cháng)期培養時(shí)，淋巴細胞中要加入生長(cháng)因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細

胞生長(cháng)；

細胞換液一般每隔 3 天需半量換液一次；

細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行；

(二)原代細胞的維持

貼壁細胞長(cháng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，未達到飽和密度，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I養成分以滿(mǎn)足

細胞繼續生長(cháng)繁殖的需要；

換入等量*培養基或換成含 2%小牛血清的維持液；

懸浮細胞細胞培養基中不僅會(huì )發(fā)生轉化而且會(huì )發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養基中的營(yíng)養成分并不

能維持細胞的營(yíng)養需求，需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法；

二、原代細胞培養的初次傳代

原代培養后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度；貼壁細胞的相互匯合，使整個(gè)瓶

底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續生長(cháng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養，這種使原代細胞經(jīng)分散接

種的過(guò)程稱(chēng)之為傳代。

初次傳代應注意以下幾點(diǎn)：

(1)細胞生長(cháng)密度不高時(shí)，不能急于傳代。

(2)原代培養的貼壁細胞需控制消化時(shí)間。

(3)吹打已消化的細胞應減少機械損傷。

(4)初次傳代時(shí)細胞接種數量要多一些。

(5)初次傳代培養的 pH 應偏低些。小牛血清濃度可加大至 15%～20%左右

三、傳代細胞的傳代培養

傳代細胞，可根據不同細胞采取不同的方法進(jìn)行細胞傳代。貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代，部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進(jìn)行傳代。

貼壁細胞的消化傳代步驟

(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以 25mL 培養瓶為例）。

(2)每瓶加入 2mL，無(wú)鈣、鎂 PBS，漂洗一次后倒掉。

(3)每瓶加入 1mL 消化液（0.25%胰蛋白酶或 0.02%EDTA 或混合液），輕輕搖動(dòng)培養瓶，經(jīng)消化液鋪滿(mǎn)所有細胞表面，待細胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀(guān)察到“薄膜”現象時(shí)，倒掉消化液，再繼續作用 2～3 分鐘，輕輕搖動(dòng)，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái)，在顯微鏡下可發(fā)現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時(shí)應立即終止消化。

(4)加入*培養基 5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的機械損傷。

(5)用計數板計數，計算細胞的濃度，并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。

四、傳代細胞的建系和維持

細胞系的維持通過(guò)換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來(lái)實(shí)現；

對每一個(gè)細胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持必須記錄好細胞檔案,換液傳代和做好細胞系（或株）的鑒定和管理工作；

原代細胞的純化和克隆

體外培養的細胞絕大多數都呈混合生長(cháng)，為了保證實(shí)驗結果的可靠性、一致性、穩定性和可重復性，要求采用單一種類(lèi)細胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗，因而培養細胞的純化就成為實(shí)驗研究的重要一步。

一、細胞的純化

細胞的純化分為(一)自然純化：長(cháng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(cháng)慢的細胞，最后留下生長(cháng)優(yōu)勢旺的細胞，達到細胞純化的目的。如腫瘤突變細胞通過(guò)此方法建立細胞系。

(二)人工純化：利用人為手段造成某一細胞生長(cháng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細胞的生長(cháng)從而達到純化細胞的目的。主要有以下 5 種方法。

1．細胞因子依賴(lài)純化法：通過(guò)加入某些特殊的細胞因子而純化出只依賴(lài)于這種細胞因子生長(cháng)的細胞系。

2．酶消化法：利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi)，達到純化的目的。另外對貼壁細胞與半貼壁及粘附細胞間的分離純化也是十分有效的。

（1）上皮細胞與成纖維細胞的分離純化

兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長(cháng)的時(shí)間才脫壁，特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開(kāi)，

（2）骨髓基質(zhì)肌樣細胞的純化

在血液細胞和骨髓細胞靜置培養時(shí)，常有許多肌樣細胞和骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長(cháng)，但也有許多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上，種類(lèi)混雜，鑒于粘附細胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細胞脫壁分離，以達到骨髓基質(zhì)細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開(kāi)和純化的目的。

3．機械刮除法

原代培養時(shí),如果上皮細胞和成纖維細胞為分區成片混雜生長(cháng)，每種細胞都以小片或區域性分布的方式生長(cháng)在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域;

4．反復貼壁法

成纖維細胞其貼壁過(guò)程快，能在短時(shí)間內完成附著(zhù)過(guò)程，而上皮細胞在短時(shí)間內不能附著(zhù)或附著(zhù)不穩定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細胞。

5．電烙篩選法

在貼壁細胞轉化時(shí)，在培養瓶的細胞層中會(huì )出現分散的轉化灶，細胞密集、排列規則，有明顯生長(cháng)趨勢，與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限，可用機械刮除法去除或用電烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。

二、細胞的克隆化

細胞克隆技術(shù)又稱(chēng)單個(gè)細胞分離培養技術(shù)，即從細胞群體中分離出一個(gè)細胞，并使其在體外培養體系中能繁殖成新的細胞群體，這種由單個(gè)細胞所形成的細胞群（或集落）稱(chēng)為一個(gè)克隆，這種純化后的細胞群體稱(chēng)為細胞株。

主要的克隆方法有 5 種

（一）毛細管克隆法

（二）有限稀釋克隆法

（三）平皿克隆分離法

（四）軟瓊脂克隆分離法

（五）單細胞顯微克隆法

毛細管克隆法：

（1）將一定量的細胞懸液（如 105/mL 或更低）稀釋至 1 個(gè)細胞/mL；

（2）取 10mL 稀釋的細胞懸液，用直徑為 0.5mm，長(cháng)為 8mm 的毛細玻璃管若干（30～50 只），在負壓作用下，使懸液吸入各毛細管中；（3）在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細胞的毛細管，然后放入適應性培養基或有飼養層細胞的培養瓶（或培養板）內；

（4）在 CO2 培養箱中培養，由一個(gè)細胞在毛細管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個(gè)克隆的細胞群體。

有限稀釋克隆法：

(1)取對數生長(cháng)期的細胞制成懸液(貼壁細胞用 0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺

盼藍染色計數，測定活細胞數及濃度（細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應高于 90%以上）。

（2）將細胞懸液在試管中稀釋?zhuān)门囵B基將細胞稀釋至 50 個(gè)細胞/mL、10 個(gè)細胞/mL、5

個(gè)細胞/mL，將 3 種稀釋度的細胞分別接種于 96 孔板中，每孔為 0.1mL，于 37℃5%CO2

下培養。

（3）次日在倒置顯微鏡下觀(guān)察培養板各孔中的細胞數，挑選只含一個(gè)細胞的孔，做好標記

并補加 0.1mL 培養液繼續培養。

（4）培養期間，視 pH 值的變化決定是否換液或補加培養液，一周左右，孔中有明顯克隆

出現。

（5）待克隆長(cháng)至孔底面的 1/3～1/2 時(shí)，可用消化法將 96 孔中的單一克隆的細胞分別移至

24 孔板中進(jìn)行擴大培養。

平皿克隆分離法：

(1)將對數生長(cháng)期細胞制備單個(gè)細胞懸液（懸浮細胞用吸管吹打分散，貼壁細胞先用 0.25%

胰蛋白酶消化后，再用培養基吹打分散）計數并用培養基調整細胞濃度，使 5mL 培養液內

含有 50～200 個(gè)細胞（細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應大于 90%以上）。

(2)將上述細胞懸液迅速移入 60mm 平皿中，在 37℃5% CO2 下培養 1 周或更長(cháng)。若有明

顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀(guān)察克隆形成的情況，標記單個(gè)克隆周邊，吸干培養基，用涂有

少量無(wú)菌硅脂的無(wú)菌金屬套環(huán)，套住標記的克隆，在套環(huán)內滴加少量 0.25%胰蛋白酶，待

細胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉入小平皿或 24 孔板或 6 孔板中擴大培養。

②玻片法：在接種細胞懸液前，預先在 60mm 平皿中放入無(wú)菌小玻片，加入細胞懸液，培

養一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標記上含一個(gè)克隆的玻片，然后用無(wú)菌鑷子取出標記玻片轉

入 24 孔培養板中繼續培養。

軟瓊脂克隆分離法：

(1)將對數生長(cháng)期的細胞制成單個(gè)細胞懸液?jiǎn)蝹€(gè)細胞)作活細胞計數，調整細胞濃度至 1×106

細胞/L，然后根據實(shí)驗要求再作梯倍稀釋。通常以 1~5×104 個(gè)細胞/L 為佳。

(2)制備底層瓊脂取 5%瓊脂置沸水中，使瓊脂*溶化，取出一份 5%瓊脂，移入小燒杯中，

待冷至 50℃，迅速加入 9 份預溫 37℃的新鮮培養液（即成為 0.5%瓊脂），混勻后立即注入

24 孔培養板中，每孔含 0.5% 瓊脂 0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。

(3)制備上層瓊脂取 37℃保溫的、不同濃度的細胞懸液 9.4mL，移入小燒杯中，加入 50℃

5% 瓊脂 0.6mL 迅速混勻，即配成 0.3%瓊脂培養基，立即澆入鋪有底層瓊脂的 24 孔培養

板中，每孔 0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。

(4)于 37℃5% CO2 下培養 1~2 周或更長(cháng)，若需培養更長(cháng)時(shí)間可補加 0.8mL/孔含瓊脂的培

養液，待有明顯集落形成為止。

(5)集落（克?。┯嫈翟诘怪蔑@微鏡下觀(guān)察并計數直徑大于 75μm 或含有 50 個(gè)細胞以上的

克隆。

生成克隆數集落(克隆)形成率(%)= ————————×100%

每皿接種細胞數 單個(gè)細胞的數目

單個(gè)細胞百分率(%) = ———————————————×100%單個(gè)細胞數目+2 個(gè)以上細胞群數目

單細胞顯微克隆法：

是借助顯微操縱器，在顯微鏡監控下將單個(gè)細胞逐個(gè)吸出，移入含有飼養層細胞的培養板中

進(jìn)行培養克隆的方法。

（1）飼養層細胞的制備：

①用 0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(cháng)的 3T3 細胞，調整細胞濃度為 108 細胞/L，在 96

孔板中每孔加入 0.1mL 細胞懸液于 37℃5% CO2 中培養至單層。

②將已形成單層的 3T3 細胞板，用 60Co γ線(xiàn)以 4000～6000 拉得輻射（終濃度為 10-6mol/L）作用 16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持 pH 而且還可為克隆細胞提供必要的養分及刺激生長(cháng)的因子。

(2)制備單個(gè)細胞懸液方法同上。

(3)分離單個(gè)細胞方法多樣，如：

①毛細管吸入法同上述毛細管法，在顯微鏡下將只有一個(gè)細胞的毛細管取出。

②微滴法將經(jīng)稀釋至 103 個(gè)細胞/L 的單個(gè)細胞懸液，用無(wú)菌的 1mL 注射器逐滴加在平皿中

制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細胞的液滴，再用毛細管取出單個(gè)細胞懸滴。

③液體石蠟法將經(jīng)稀釋至 103 個(gè)細胞/L 的單個(gè)細胞懸液，用無(wú)菌的 1mL 注射器逐滴加入充

滿(mǎn)無(wú)菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細胞液滴，仔細用毛細吸管取出

有一個(gè)細胞的液滴。

④玻璃小球附著(zhù)法將稀釋至 103 個(gè)細胞/L 的細胞懸液加入表面涂有無(wú)菌凡士林石蠟的小玻

璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細胞的玻珠，仔細用鑷

子取出。(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細胞，放入預先制備飼養層細胞的 96 孔培養板中，于 37℃

5% CO2 下培養 1~2 周或更長(cháng)。

(5)待細胞克隆明顯，并使孔底覆蓋 1/3～1/2 時(shí)，即可將細胞轉種于 24 孔板進(jìn)行擴大培養

（貼壁細胞仍需用 0.25%胰酶消化法取出轉種）。人或動(dòng)物體內(或胚胎組織)由于多種細胞結合緊密，不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁殖，

即使采用 1mm3 的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長(cháng)，若需獲取大量細

胞，必須將現有的組織塊充分散開(kāi)，使細胞解離出來(lái)，常采用的方法如下：

一、懸浮細胞的分離方法

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，較為簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的

低速離心 10 分鐘，若懸液量大，可適當延長(cháng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(cháng)，

以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂 PBS 洗兩次，用培養基洗一次后，調整

適當細胞濃度后再分瓶培養，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，

經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。

不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見(jiàn)淋巴細胞分離培養的章節。

二、實(shí)體組織材料的分離方法

對于實(shí)體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，

可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。

(一)機械分散法

所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織

細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(用九號針)，使細胞通過(guò)針頭壓出，或在不銹

鋼紗網(wǎng)內用鈍物壓擠(常用注射器鈍端)使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡(jiǎn)便、快

速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。

(二)消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團塊(或糊狀)，應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步

使細胞間的橋連結構松動(dòng)，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機械法，用吸管吹打

分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個(gè)細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長(cháng)。

1、酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：

(1) 胰蛋白酶分散技術(shù)

胰蛋白酶(簡(jiǎn)稱(chēng)胰酶)是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，

主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi)，在

常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細胞的

作用，取決于細胞類(lèi)型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機鹽離子、pH 以及消化

時(shí)間的長(cháng)短等。

①細胞類(lèi)型 胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊

膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織，如 乳腺、滑膜、子宮、纖維

肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效，但若與膠原酶合用，就能增加其對組織的分離作用。

②酶的活力 市售的胰蛋白酶，其活力都經(jīng)過(guò)測定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低

溫冰箱中，消化時(shí)的 pH 和溫度都要適宜，否則會(huì )影響活力，細胞的分散直接與酶的活力有

關(guān)，最終使用活力為 1:200 或 1:250,56℃pH8.0 時(shí)活力*。

該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內溫度不宜過(guò)高，保存時(shí)間不能太長(cháng)，若粉劑結團塊，說(shuō)明

該部分受潮或失效。

③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為 0.1%-0.25%(活力 1:200 或 1:250)，但遇到難消化

的組織時(shí)，濃度可適當提高，消化時(shí)間適當延長(cháng)。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋

白酶在培養液中可促進(jìn)細胞的增殖，若培養液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰

蛋白酶因子所清除。

④溫度 一般認為胰蛋白酶在 56℃時(shí)活性*，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為 37℃，通常在 37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。

⑤pH pH8~pH9 是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分

散快，細胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細胞時(shí) PH 只能選用 7.6~8.0 之間，否則對細胞有

損傷。

⑥無(wú)機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類(lèi)溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化

作用。因此，在配制時(shí)應采用無(wú)鈣鎂離子的 PBS 配制。

⑦消化時(shí)間 如果細胞消化時(shí)間過(guò)長(cháng)，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般

消化時(shí)間為 20 分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于 4℃過(guò)夜也可。

分離方法如下：

①過(guò)夜冷消化 將取得的組織用 Hanks 液洗三次，剪成碎塊大小為 4 毫米左右，用 Hanks

液洗 2~3 次以除去血球和脂肪組織，再加入 0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放 4℃過(guò)夜，次日

再用 Hanks 液洗滌，棄去上清，共洗 2~3 次，然后，加入少量營(yíng)養液吹打分散，細胞計數，

按適當的濃度分瓶培養。

②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：

熱消化多次提取--將剪碎的細胞塊加入 0.25%胰蛋白酶 37℃水浴中消化 15~20 分鐘，然后

經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散制成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養，然后將留下的未*消化的

組織按上述方法操作，再消化提取細胞。

冷消化多次提取--方法同上，只是消化溫度為 4℃。

先熱消化后冷消化--將組織塊先用胰蛋白酶于 37℃下消化 20 分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散，

制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于 4℃下過(guò)夜，次日再提取細胞，分散成

懸液，分瓶培養。

(2) 膠原酶(Collagenase)消化法膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上

皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠

原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用 PBS

和含血清的培養液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細胞成活率，最終濃度 200u/mL 或

0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用緩和，無(wú)需機械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加

實(shí)驗成本。

經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未

被*消化開(kāi)。成小團塊的上皮細胞比分散的單個(gè)上皮細胞更易生長(cháng)，因此不必要再進(jìn)一步

消化處理。

鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見(jiàn)表 4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)

間(小時(shí))有差異(見(jiàn)表 4-2)，以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還

可加透明質(zhì)酸酶(對細胞表面糖基有作用)，采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、

癌組織非常有效。

表 4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別

項 目

胰蛋白酶

膠原酶

消化特性

適用于消化軟組織

適用于消化纖維多的組織

用 量

0.01%~0.5%

0.1~0.3mg/mL（200u/mL）

消化時(shí)間

0.5~2 小時(shí)（小塊）

1~12 小時(shí)

pH

8~9

6.5~7.0

作用強度

強烈

緩和

細胞影響

時(shí)間過(guò)長(cháng)有影響

無(wú)大影響血清、鈣、鎂離子 有影響

無(wú)影響

表 4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5~1cm3)

酶 種 類(lèi)

較 硬 組 織

軟 組 織

4℃ 室 溫 37℃

4℃ 室 溫 37℃

胰蛋白酶（0.25%）

24~48 1~6

1~2 12~24 1~2 0.5~1

膠原酶（200u/mL）

24

6

6.5

12

3

0.25

兩者聯(lián)合（對沖）

12~46 12~24 4~12 12~24 6~12 1~2

除上述兩種較為常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋

白酶，近年來(lái)，還有一種從灰霉菌中提取的 Pronase 新酶分散細胞更佳。

2、非酶消化法(EDTA 消化法)

EDTA 是一種非酶消化物，又稱(chēng)螯合劑或 Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂

離子的 PBS 配成 0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)

能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使

貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團塊，常

不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用(1:1 或 2:1)，不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可

降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分離法的操作步驟：

(1)剪切 把組織塊剪碎，呈 1~5mm3 大小的組織塊。

(2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無(wú)鈣鎂 PBS 洗 2-3 次(采用傾斜，自然沉

降法)。

(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA)于 37℃水浴中作用適當時(shí)間(中間可輕搖

1~2 次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。

(4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

(5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗 2-3 次

后，加入*培養基。

(6)機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或 3~4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后

分瓶培養，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘，吸上層細胞懸液進(jìn)行分瓶培養。

注意事項如下：

(1)組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作

用。

(2)胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(cháng)，以避免毒性作用。

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細

胞隨漂洗而丟失。

 

 

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