今天我們談一談 RNA 抽提的問(wèn)題。為了方便大家記憶，總結出了“三大紀律八項注意"。

紀律一：無(wú)外源酶的污染。 

外源酶會(huì )造成 RNA 的降解，造成 RNA 得率太低，或者*失敗。而外源酶又是無(wú)處不在的。這就要求注意以下三點(diǎn)：

注意一：嚴格戴好口罩，手套。手指和呼吸時(shí)重要的外源酶的來(lái)源。所以童鞋們做 RNA 抽 提的時(shí)候，還是要全副武裝起來(lái)。這對自己也是一種保護措施。 

注意二：實(shí)驗所涉及的離心管，槍頭，移液器，實(shí)驗臺面等要*處理。離心管和槍頭要用 DEPC 處理過(guò)，單純的消毒滅菌可不行呀。移液器和實(shí)驗臺面等要用 75%的酒精擦過(guò)。 

注意三：實(shí)驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。

紀律二：無(wú)內源酶的活性。 

這個(gè)和紀律一是一脈相承的。目的都是減少 RNA 的降解，提高最終的得率。而所有的組織都含有內源酶，這就要求我們在實(shí)驗過(guò)程中，千方百計滅活內源酶。這也就誕生了下面的四大注意事項： 

注意四：選擇合適的勻漿方法。新鮮樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃ 冰箱保存。在碾磨前，碾磨用具也必須預冷。在碾磨過(guò)程中，一邊碾磨，一邊補充液氮。樣品碾碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時(shí)，將樣品迅速轉移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。

注意五：選擇合適的裂解液?，F在市場(chǎng)上常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性。但是，高內源酶含量的樣品，如肝臟，脾臟等組織，建議使用含苯酚的裂解液。苯酚的滅活內源酶的能力是很強的。 

注意六：控制好樣品的起始量。如果樣品的塊頭太大，所有的細胞無(wú)法迅速和裂解液接觸。里面沒(méi)有接觸到細胞的 RNA 很快就會(huì )被內源酶降解。所以，起始量不要太大。如果塊頭太大，要把它切成小塊小塊的。

紀律三：明確抽提目的。 

我們做每一個(gè)實(shí)驗，甚至每一個(gè)步驟，都要清楚這樣子做的目的是什么。RNA 用于不同的實(shí)驗，其質(zhì)量的要求是不一樣的。那么，這就誕生了下面的最后兩條紀律： 

注意七：任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。所以，要進(jìn)行樣品的破碎和勻漿。其目的是為了使 RNA *地完整地釋放出來(lái)。如果樣品是細胞，則無(wú)須破碎即可直接勻漿；如果是組織，甚至器官，那就需要破碎后才能勻漿；如果是酵母菌和細菌，則需要先用相應的酶破壁后才能勻漿。

注意八：RNA 抽提成功的一個(gè)經(jīng)濟的標準是后續實(shí)驗的一次成功，而不是得率。我們?yōu)槭裁匆樘?RNA？是為了后面的實(shí)驗，例如原位雜交，免疫沉淀等等。所以，一定要明確后面到底是要干嘛？cDNA 文庫構建要求 RNA 完整而無(wú)酶反應抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶 反應抑制物殘留要求嚴格。不用每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，從而造成不必要的浪費。

綜上所述，對大部分實(shí)驗者來(lái)說(shuō)，RNA 抽提比 DNA 抽提要困難得多。所以，我們要個(gè)個(gè)牢記，三大紀律八項注意。