酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）因其具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應用于臨床檢測中的各種抗原和抗體的測定。盡管 ELISA 操作簡(jiǎn)單，但是小實(shí)驗里也蘊含著(zhù)大文章，ELISA 操作各個(gè)環(huán)節對實(shí)驗的檢測效果影響較大，稍不注意就會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結果?，F在就跟大家 818 應用 ELISA 應該了解的一些常識。

ELISA 分類(lèi)及具體過(guò)程 

一般，ELISA 可分為以下四大類(lèi)：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA、競爭抑制 ELISA。其他的 ELISA 都隸屬于這四類(lèi) ELISA 或由這四類(lèi) ELISA 組合衍生。下面分析 ELISA 實(shí)驗操作中可能影響結果的原因，并給出相應的解決方法。

樣品收集和保存 

用于 ELISA 測定較為常用的臨床標本是血清（漿）。要注意避免嚴重溶血，因為血紅蛋白中含有具有類(lèi)似過(guò)氧化物活性的血紅素基團，在孵育時(shí)很容易吸附于固相，與 HRP 底物反應產(chǎn)生假陽(yáng)性。 

樣品采集及血清分離中要注意避免細菌污染，一方面細菌分泌的酶可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用，另一方面，細菌的內源性酶如大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶會(huì )對相應酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 

樣品應該要避免反復凍融。因反復凍融所產(chǎn)生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結果。另外，樣品混勻時(shí)，不要劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。 

一般而言，如果在收集樣品的當天進(jìn)行檢測，可將樣品及時(shí)儲存在 4℃備用；而對隔天再檢測的樣本，應及時(shí)分裝后凍存在-20℃備用，若要長(cháng)期保存樣品，最好將其置于-70℃凍存。

試劑準備 

在實(shí)驗開(kāi)始前，需將試劑盒從冰箱中拿出來(lái)在室溫放置 20min，再進(jìn)行測定，以使試劑盒在 使用前與室溫平衡，也可使溫育時(shí)反應孔內的溫度能較快的達到所要求的高度，以滿(mǎn)足測定 要求。 

其次，目前商品中 ELISA 試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗過(guò)程中對其所提供的濃縮液進(jìn)行稀釋 配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應該保證質(zhì)量。此外，底物反應液應該反應顯色 前進(jìn)行現配現用。同時(shí)，為了保證實(shí)驗的均一性，實(shí)驗中所有試劑在加樣前必須搖勻。

加樣 

因 ELISA 的靈敏度較高，則應該按規定將血清稀釋至適當的倍數，以降低非特異性反應，使特異性的抗原抗體反應充分體現出來(lái)。 

加樣品時(shí)，單孔用量要求：≥20ul/指標，如需要做 2 個(gè)復孔則血量≥60ul/指標。如果用量充足，最好提供 50ul/孔/指標。具體用量也需根據試劑盒的要求而定。 

吸取樣品時(shí)，加樣槍頭不應粘附多余的液體；加樣時(shí)不可 90 度向孔中滴加液體，否則會(huì )導致液體殘留在吸頭上，加樣不準確。正確加樣方法應為 45 度，吸頭貼著(zhù)孔壁和液面的交界處加入。

加樣時(shí)速度不可過(guò)快，否則無(wú)法保證微量加樣的準確性和均一性；要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對鄰近孔產(chǎn)生污染。

孵育 

一般，孵育時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，所需時(shí)間相對較短。較為常用的孵育溫度為 37℃，孵育 1-2h。 

孵育時(shí)應貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗。孵育時(shí)，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時(shí)，應嚴格控制孵育時(shí)間，避免因時(shí)間過(guò)長(cháng)導致緊附于反應孔周?chē)姆翘禺愋越Y合。 

孵育時(shí)，要盡量排除“邊緣效應"，即 96 孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因，是因為 96 孔板周孔與中心孔的表面或熱力學(xué)特征不同。因此，可采用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至孵育溫度（37℃）。

洗板 

為了確保 ELISA 測定的特異性，洗板可清除非特異性結合物質(zhì)，減少背景信號，增加分析的信噪比。 

手工洗板時(shí)，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復合物脫離。使用半自動(dòng)洗板時(shí)，應經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出。為了達到較好的洗滌效果，實(shí)驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，即在機器洗滌后再進(jìn)行人工洗板 1-2 次。

以 HRP 作為標記酶的 ELISA 試劑盒中使用的洗板液一般為含 0.05% Tween20 的中性 PBS，其中，吐溫 20 的濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實(shí)驗的靈敏度。

顯色 

目前以 HRP 作為標記酶的商品 ELISA 試劑盒中，如以 TMB 為底物，則提供的底物為 A 和 B 兩瓶應用液；如以 OPD 為底物，則試劑盒提供 OPD 片劑或粉劑，臨用前配制。顯色劑配制后放置時(shí)間過(guò)長(cháng)（肉眼可見(jiàn)淺藍色的 TMB 時(shí)）要棄之不用。 

在加入底物開(kāi)始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將 A 和 B 兩種液各加一滴于清潔的空板孔或 eppendorf 管中，觀(guān)察是否有顯色出現，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。 

顯色反應條件一般為 37℃或室溫反應 15-30 分鐘。加終止液時(shí)，要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽(yáng)性。

讀板 

讀板時(shí)要保證酶標板清潔，同時(shí)也要注意酶標儀的波長(cháng)是否已調至合適或所用濾光片是否正確。 

通常，單波長(cháng)讀板的測定值一般是指以對顯色具有最大吸收的波長(cháng)如 450nm 或 492nm 進(jìn)行比色測定；而雙波長(cháng)讀板的測定值一般是敏感波長(cháng)如 450nm 的吸光值與非敏感波長(cháng)下如 630nm 的吸光值之差，可排除板內臟物的影響。 

同時(shí)，由于 ELISA 測定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在 ELISA 測定比色時(shí)，最好是使用雙波長(cháng)比色。

數據結果分析 

ELISA 的測定結果可分為兩種：定性測定和定量測定。前者只需確定陰性或陽(yáng)性即可；后者則需要給具體的數值。在定量測定中，經(jīng)常要將標準品所獲得的吸光值進(jìn)行標準曲線(xiàn)的繪制。 

下面則簡(jiǎn)單介紹用 excel 繪制標準曲線(xiàn)的方法 

1）輸入相應數據

2）選中相應數據

3）選擇表格中，菜單欄中的插入|散點(diǎn)圖中第一個(gè)類(lèi)型

4）選中“圖表工具"中的“快速布局"中 fx 圖標，即可得到以下圖表。Excel 版本較低的可以直接跳到第 6）步。

5）點(diǎn)中坐標軸標題，可做修改。修改后可獲得以下標準曲線(xiàn)。

6）或者在較低版本的 excel 中，在“圖表工具"選項中，選擇趨勢線(xiàn)|線(xiàn)性趨勢線(xiàn)。

7）選中圖表中的趨勢線(xiàn)，右鍵，選擇“設置趨勢線(xiàn)格式"，在彈出的對話(huà)框中，將“顯示公式" 勾選上，點(diǎn)擊關(guān)閉，也獲得標準曲線(xiàn)。

8）可將試驗管中所測的吸光度值代入圖表中的公式 Y=1.001x+0.0171 后可得到所求成分的含量，即 X 的值。

ELISA 的疑難雜癥 

1）顯色淺，靈敏度低

2）假陽(yáng)性多，本底高甚至花板

3）重復性不好

4）白板