作用原理

高保真DNA聚合酶含有聚合中心和酶切中心[1]，聚合中心具有5’-3’聚合酶活性，負責聚合作用；酶切中心具有3’-5’外切酶活性（也稱(chēng)校對活性），負責將不配對的核苷酸予以切除。

在PCR擴增過(guò)程中，當引物與模板*互補后，進(jìn)入聚合中心，在聚合酶活性作用下，游離的脫氧核苷酸通過(guò)互補配對原則，依次結合到引物的3’端，新鏈DNA從5’到3’進(jìn)行延伸（圖1-a）；當引物末端結合的核苷酸與模板不配對時(shí)（圖1-b），錯配的核苷酸會(huì )翹起，新鏈DNA無(wú)法繼續向前延伸，進(jìn)而進(jìn)入酶切中心，在外切酶活性作用下，錯配的核苷酸會(huì )被切除（圖1-c）；切除后此位點(diǎn)會(huì )重新結合正確的核苷酸，新鏈DNA又能繼續從5’到3’進(jìn)行延伸（圖1-d），最終使新鏈DNA能夠進(jìn)行精準復制[1-2]。

圖1. 高保真DNA聚合酶工作原理示意圖[1-2]

應用方向

基因功能研究

案例：研究表明A基因可能參與擬南芥中花青素的代謝，為了驗證這一假設，要先將A基因從擬南芥中擴增出來(lái)，構建到過(guò)表達或抑制表達載體上，通過(guò)農桿菌介導法轉入擬南芥中，使A基因在擬南芥體內過(guò)表達或抑制表達，最后通過(guò)形態(tài)指標、生理指標及基因表達水平等來(lái)判定這一假設是否成立。

基因測序

案例：若想探究擬南芥中B蛋白家族中不同基因的異同點(diǎn)，需要先將B蛋白家族中的所有基因從擬南芥中擴增出來(lái)，得到這些基因的堿基序列，然后通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)初步分析它們的異同點(diǎn)。

以上研究均需借助PCR技術(shù)將目的基因從物種中精準擴增出來(lái)，如果擴增出的基因序列出現突變，那么后續分析都會(huì )不準確；為了保證目的基因的精準擴增，我們在PCR擴增過(guò)程中就需要使用高保真DNA聚合酶。

答：反應體系：10 µl

①單酶：1 µl 10×Taq Buffer（MgCl2 Plus），0.5 µl dNTP Mix (10 mM)，0.2 µl Taq DNA Polymerase，1-7 µl純化后PCR片段，ddH2O補齊至10 µl

問(wèn)Q2：高保真酶DNA聚合酶擴增的片段一定不會(huì )突變嗎？

答：高保真DNA聚合酶具有3’-5’的外切酶活性，在PCR擴增過(guò)程中可降低核苷酸錯配的概率，保真度越高的DNA聚合酶，核苷酸錯配的概率就會(huì )越低，但不表示擴增過(guò)程中絕對不會(huì )發(fā)生核苷酸的錯配。因此，為了提高實(shí)驗的成功率，建議同一樣本挑取多個(gè)（>3個(gè)）單克隆進(jìn)行測序。

問(wèn)Q3：不同公司高保真DNA聚合酶的保真度有可比性嗎？

答：高保真酶的保真度通常表示為是Taq酶的幾倍，常見(jiàn)的保真度測定方法有：藍白斑篩選測定、一代測序和NGS測序等。不同品牌DNA聚合酶的保真度測定方法不同，若想要比較不同品牌DNA聚合酶的保真度，必須采用相同的保真度測定方法，進(jìn)行平行比對。

快速高保真酶推薦

參考文獻:

[1] 黎景光. DNA聚合酶高保真原理應用于SNP檢測的研究[D]. 暨南大學(xué), 2006.

[2] Steitz TA. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem, 1999, 274(25): 17395–17398.