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實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)化(五)
發(fā)布時(shí)間: 2021-10-12 點(diǎn)擊次數: 1030次想要提高探針的的效果,可以考慮在探針上采用LNA(鎖核酸)堿基或MGB(小溝結合劑)基團。
這樣做的效果是:
1、增強探針與靶序列的雜交強度。增強結合的特異性后,背景噪聲降低,從而提高整個(gè)實(shí)驗的靈敏度。
2、一般為滿(mǎn)足設計要求,AT序列豐富的探針需要長(cháng)達40個(gè)核苷酸。通過(guò)LNA堿基或MGB的取代,可以將長(cháng)度減少至13~20個(gè)核苷酸,而不影響效果。
為什么這樣的方法可以提高探針的效果?
LNA堿基是一種核苷酸類(lèi)似物,其化學(xué)結構可以限制DNA構象為理想的Waston-Crick雙螺旋結構。每插入1個(gè)LNA堿基,可以使Tm值增加3~6°C。
MGB基團是一個(gè)能結合到DNA小溝的三肽分子,能與互補的單鏈DNA高特異性、高強度地結合。
例如SNP基因分型實(shí)驗,要求所有引物、探針復性溫度一致的多重PCR實(shí)驗,就很適合使用這個(gè)方法。
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