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學(xué)會(huì )這6步，輕松搞定transwell實(shí)驗

發(fā)布時(shí)間： 2021-11-02　　點(diǎn)擊次數： 1880次

做腫瘤研究的人，很少有不知道 transwell 實(shí)驗的，它是用來(lái)研究腫瘤細胞的遷移侵襲轉移情況的一種簡(jiǎn)便快捷的實(shí)驗方法，還可以構建兩種細胞的共培養體系以及趨化性試驗。今天咱們就來(lái)講講怎么做腫瘤細胞的侵襲轉移實(shí)驗。

Transwell 侵襲實(shí)驗，其實(shí)原理簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是用一層膜將高營(yíng)養的培養液和低營(yíng)養的培養液隔開(kāi)，細胞放在低營(yíng)養的培養液里，為了找吃的，細胞會(huì )往高營(yíng)養的培養液里面跑，但是有膜擋著(zhù)，所以要穿過(guò)膜才行。

我們在膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細胞外基質(zhì)，于是細胞就要分泌金屬蛋白酶將基質(zhì)消化了才可以從低營(yíng)養的培養液跑到高營(yíng)養的培養液里面，最后我們檢測高營(yíng)養的培養液里細胞量就可以知道細胞的侵襲能力了。而遷移實(shí)驗就是不鋪膠直接讓細胞穿過(guò)就行了。

Transwell 簡(jiǎn)易圖

以下就來(lái)為大家介紹侵襲實(shí)驗步驟：

實(shí)驗前準備：transwell 小室（一般選用 12um），24 孔板，基質(zhì)膠（corning），細胞實(shí)驗所需的基本的材料。

1

基質(zhì)膠鋪板

用 Matrigel 1：8 稀釋?zhuān)梢灾苯佑脽o(wú)血清的培養基稀釋?zhuān)?，包?Transwell 小室底部膜的上室面，置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝膠（時(shí)間不宜太長(cháng)，之前有人說(shuō)在 37 度孵箱過(guò)夜，反正元元師兄覺(jué)得不太可能）。

注意事項：

1. 鋪膠之前將槍頭以及所用的耗材至于冰箱 4 度當中，否則配膠的時(shí)候會(huì )直接凝固。
2. 鋪膠的厚度自己摸索，25ul，40ul，100ul。
3. 注意鋪膠過(guò)程不要產(chǎn)生氣泡，鋪膠均勻，否則影響實(shí)驗結果。
4. 注意無(wú)菌操作。

2

制作細胞懸液

1. 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓 12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
2. 消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，（用 PBS 洗 1－2 遍，這一步很必要，否則細胞表面覆有血清培養基，細胞沒(méi)有遷移侵襲的動(dòng)力），用無(wú)血清培養基重懸。

3

接種細胞

1. 細胞懸液 200µl 加入 Transwell 小室（腫瘤細胞數目需要摸濃度，從 2 萬(wàn)，5 萬(wàn)，10 萬(wàn)）。
2. 24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培養基，特別注意的是，下層培養液和小室間常會(huì )有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養液的趨化作用就減弱甚至消失。在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養板。
3. 養細胞：常規培養 12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h 較常見(jiàn)，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數目的影響也不可忽視。

4

固定染色

取出 Transwell 小室，棄去孔中培養液，用無(wú)鈣的 PBS 洗 2 遍，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，甲醇或者甲醛固定 30 分鐘，將小室適當風(fēng)干。用 0.1% 結晶紫染色 30-60 min，用 PBS 洗 3 遍。用棉簽輕輕擦掉上室水分。

5

計數

400 倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀(guān)察細胞，記數。

如果細胞怎么還是穿不過(guò)去?？偨Y一下幾個(gè)原因：
1.  細胞不具備侵襲轉移的能力（例如 MCF7 為非轉移性的細胞）
2.  基質(zhì)膠鋪的太厚了 (基質(zhì)膠的稀釋倍數是可以改的，基質(zhì)膠的量是可以摸的)
3.  細胞給的量太少了（200ul 里 2 萬(wàn)細胞太少，給 5 萬(wàn)，10 萬(wàn)，20 萬(wàn)唄）
4.  細胞沒(méi)有進(jìn)行預處理（這步可以免），也沒(méi)有用 PBS 洗兩遍 (這一步不可省，因為你用胰酶消化后，含血清的培養基中和，必須洗干凈了。
5.  上層的培養基為無(wú)血清培養基，下室的培養基為 15% 的血清培養基，這個(gè)濃度可以改成 20%，細胞數不夠，底下的吸引力也不夠不行哈。
6.  細胞的活性太差，半死不活的細胞做侵襲實(shí)驗傷不起哈。

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