細胞轉染是細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的一種常用的技術(shù)手段。而轉染效率低卻是實(shí)驗科研者經(jīng)常遇到的問(wèn)題，尤其是原代細胞轉染，更是因為難度大，號稱(chēng)誰(shuí)碰誰(shuí)死，而令人談虎色變。不，應該是談原代細胞色變。

當實(shí)驗進(jìn)行到轉染這一步時(shí)有哪些坑要避免?需要注意的因素有哪些呢?

細胞系選擇有時(shí)是實(shí)驗的需要，有時(shí)是實(shí)驗室條件的限制。如果有選擇的余地當然挑個(gè)容易做的。越是接近體內的真實(shí)情況的原代細胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時(shí)需要根據細胞系來(lái)選擇合適的轉染方法;而有時(shí)一些啟動(dòng)子在不同的細胞系中表現的功能也不同。這些都是設計實(shí)驗時(shí)需要考慮的因素，姑且不論。不過(guò)因為受限于特定的細胞，如何選擇合適的轉染方法就值得考究了。因為不同的細胞可能適用不同的轉染試劑和轉染條件。如果實(shí)驗室已經(jīng)建立了全套方法，照做可也。如果是個(gè)新來(lái)的細胞株，最好查查資料看哪些成功轉染案例。

我們做轉染的時(shí)候，在開(kāi)展正式實(shí)驗前要多做預試驗，優(yōu)化轉染條件。優(yōu)化轉染條件包括：試劑的用量、DNA密度、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間等等。

做電轉的時(shí)候，如果電壓太大，往往會(huì )發(fā)生細胞大量死亡的情況。不同的細胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實(shí)驗，多摸索條件。對于大多數細胞來(lái)說(shuō)，其最佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進(jìn)行轉染的細胞應該處于對數生長(cháng)期。處于對數生長(cháng)期的細胞的抗損傷能力是*的。細胞濃度應該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉染的質(zhì)粒應該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉染效率也大大降低。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細胞恢復損傷。

有時(shí)候轉染效率低下，還要考慮會(huì )不會(huì )存在試劑過(guò)期的情況。有老師當時(shí)做轉染整整半年，百思不得其解。最后發(fā)現，原來(lái)是轉染試劑過(guò)期了。換了之后，立馬成功。根據經(jīng)驗，盡量使用開(kāi)封半年內的，因為過(guò)了半年后，就算沒(méi)有過(guò)失效期，但是細胞毒性大大增加，而轉染效率卻大大下降。千萬(wàn)不要為了省錢(qián)，影響實(shí)驗進(jìn)度哈。而現在，出了第三代多肽小分子材料的轉染試劑，對細胞毒性低，適用細胞廣，轉染效率高，這邊十分推薦ZETA LIFE品牌的Advanced系列DNA、RNA的轉染試劑，合適目錄大多數的細胞轉染實(shí)驗。

轉染后未及時(shí)加入血清，會(huì )導致細胞大量死亡。如果用的是Lipo系列的脂質(zhì)體材料轉染試劑一般要在轉染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養基。如果是Advanced系列DNA、RNA的轉染試劑則為轉染24小時(shí)后進(jìn)行正常換液，不能像Lipo系列轉染試劑一樣在4-6小時(shí)后換液。其實(shí)也可以在原來(lái)的無(wú)血清培養基里面滴加血清。這個(gè)時(shí)候，最好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過(guò)早加入血清。過(guò)早的話(huà)，會(huì )引起未轉染的細胞快速生長(cháng)。那么，什么是最佳時(shí)機呢?在20%的細胞變圓的時(shí)候，就是加血清的最佳時(shí)機。不過(guò)要特別注意：對于RNA轉染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的，一般建議使用超低內毒素胎牛血清。新加培養基的預熱對細胞轉染很有幫助。

細胞污染也是造成細胞死亡，轉染效率低下的一大原因。首先，轉染細胞用的質(zhì)粒必須保證無(wú)菌。而現在市場(chǎng)上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到絕對無(wú)菌。業(yè)內有個(gè)一個(gè)獨門(mén)絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75%乙醇沉淀，這樣就除菌了。

轉染用的質(zhì)粒首先要保證數量，一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質(zhì)，也會(huì )影響轉染效率。這個(gè)時(shí)候，就應該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮。

在轉染之前更換一次37℃預溫的培養基，可提高轉染效率。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來(lái)，從培養皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節，但是如果不注意的話(huà)，也會(huì )造成轉染效率低下。

轉染前細胞最好經(jīng)過(guò)1—2次傳代，以保證細胞生長(cháng)旺盛，容易轉染。注意，貼壁細胞生長(cháng)到幾乎滿(mǎn)片時(shí)就要趕快進(jìn)行下一次傳代，千萬(wàn)不要使細胞保持融合超過(guò)24小時(shí)，因為一旦長(cháng)滿(mǎn)了，細胞們就“故步自封"不思轉染啦?；盍Τ渑娴哪贻p細胞更容易接受外來(lái)的新鮮事物嘛。

大多數已建立的細胞系都是非整倍體，細胞培養在實(shí)驗室中保存數月和數年后會(huì )經(jīng)歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化，這會(huì )導致和轉染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會(huì )恢復原先的轉染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率(融化細胞的進(jìn)一步傳代不會(huì )馬上降低轉染效率)。因此，如果觀(guān)察到轉染效率降低，可以試著(zhù)轉染新鮮培養的細胞以恢復最佳結果。

轉染時(shí)的細胞密度對轉染效率影響非常顯著(zhù)。不同的轉染試劑，要求轉染時(shí)的最適細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì )因不同的細胞類(lèi)型或應用而異。轉染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細胞密度會(huì )導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗并為以后的實(shí)驗建立一個(gè)穩定方法，包括適當的接種量和培養時(shí)間等等。一般轉染時(shí)貼壁細胞密度為40%-80%，但這個(gè)需要參考所選轉染試劑的說(shuō)明書(shū)——陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數，有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%—80%之間，總之是盡量在細胞最適的生理狀態(tài)下轉染，以求最佳的轉染效果。

不同的實(shí)驗目的也會(huì )影響轉染時(shí)的鋪板密度，比如研究細胞周期相關(guān)基因等表達周期長(cháng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉染的試劑需要特別注意。

健康的細胞培養是一切成功轉染的基礎。不同的細胞類(lèi)型有不同的特性，需要特定的培養基、血清、補充添加劑等等。

支原體、細菌、真菌污染，無(wú)論對于細胞培養或者轉染都是“不堪回首的痛"，可能會(huì )嚴重影響轉染結果，細胞培養過(guò)程中往往會(huì )添加抗生素來(lái)防止污染。但是這些添加劑可能對轉染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉染的培養基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細胞。這可能間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。所以整個(gè)過(guò)程都不要用抗生素。