細胞培養，受人員操作和環(huán)境條件的影響比較大，在細胞培養中常常會(huì )遇到很多的細節問(wèn)題，而每個(gè)問(wèn)題都有可能導致細胞培養的失敗。所以做好細胞的污染防治是能否順利開(kāi)展細胞實(shí)驗的必要措施。

1.細菌污染

細菌污染是細胞培養中最常見(jiàn)的污染，主要由操作不慎或使用了滅菌不*的耗材與試劑引入。最常見(jiàn)的有枯草桿菌、大腸桿菌、假單胞菌及白色葡萄球菌。鏡下形態(tài)則為長(cháng)桿狀、短桿狀和顆粒狀等。

左邊的就是比較典型的桿菌污染，一般桿菌會(huì )延軸向快速游動(dòng)，量少時(shí)培養基澄清。右圖是顆粒狀污染，一般培養基會(huì )渾濁或有白色沙狀沉淀。

好氧菌增殖分裂迅速，感染24h內即可使培養基渾濁；厭氧菌在常規細胞培養條件下增殖緩慢，需要較長(cháng)時(shí)間才會(huì )觀(guān)察到渾濁現象。

污染處理：由于國內細胞培養中抗生素使用泛濫，所以出現污染后加雙抗（青霉素&鏈霉素，Penicillin + Streptomycin）一般沒(méi)有效果。桿菌可選用100ug/ml慶大霉素處理一周，顆粒狀細菌可用25ug/ml環(huán)丙沙星處理一周，效果相對還不錯。

2. 真菌污染

細胞培養中最常見(jiàn)的污染真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

左邊這張是比較典型的霉菌污染的圖片，右圖是酵母污染，鏡下可以看到明顯的出芽形態(tài)。

污染處理：可用100ug兩性霉素B/T25瓶，處理一周。

注：兩性霉素毒性較大，需要在細胞有50%以上且狀態(tài)沒(méi)受大影響前處理。

3.支原體污染

支原體的危害：支原體污染可以改變細胞的特性。例如部分支原體會(huì )快速消耗培養液中的精氨酸，與細胞競爭營(yíng)養，從而使細胞的生長(cháng)速度減慢或停止；同時(shí)支原體還可以改變細胞的酶譜、細胞膜成分，造成細胞染色體異?；蚣毎±硇愿淖兊?。上述情況會(huì )嚴重影響到使用這些細胞所做實(shí)驗的結果，導致結論不可靠。

（PCR法檢測細胞上清中的支原體污染）

支原體的預防與清除：由于支原體無(wú)法在鏡下直接看到，需要通過(guò)PCR法等進(jìn)行檢測才發(fā)現，出現污染后比較難發(fā)現。建議在養細胞每月檢測一次并結合每周抽檢，做到有污染早發(fā)現。對于正在進(jìn)行支原體去除處理的細胞建議每周必檢，直至出現陰性結果并至少維持一月。不同的細胞分開(kāi)處理，優(yōu)先處理“支原體陰性"細胞，后處理正在做去除處理的和受感染的細胞。同時(shí)，新引進(jìn)的細胞系都進(jìn)行支原體檢測，確保不給實(shí)驗室帶來(lái)新的污染。

4.實(shí)驗室細胞污染防治

建立良好的規章制度對減少細胞污染會(huì )有很大的幫助。包括準入制度、操作規范和日常管理制度。

準入制度：包括了人員的和物料的。人員需要進(jìn)行培訓之后才能自己進(jìn)行操作，而且要符合穿戴要求才能進(jìn)實(shí)驗室，如白大褂、隔離服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品應嚴格消毒滅菌，而購買(mǎi)的物品需要從正規的、可靠的渠道購買(mǎi)。新買(mǎi)的細胞應檢測驗證后再使用。

操作規范：對于常規操作最好制定規范，且實(shí)驗室人員都要按操作規范進(jìn)行，不能隨意更改，同時(shí)也是培養實(shí)驗人員的良好操作習慣。比如，槍頭滴管吸完就不再二次伸入培養基中吸取，一次吸夠足夠量的培養基。加液時(shí)也應盡量做到懸空加液，這些都可有效預防支原體污染和細胞交叉污染。另外可以的話(huà)，一次只操作一株細胞，細胞與細胞間最好有一點(diǎn)時(shí)間間隔，避免交叉污染。

日常管理制度：則包括環(huán)境及耗材試劑等的使用、清潔、保養等各方面的規則、方法。還有試劑耗材等的用量、庫存及采購等的管理，包括細胞樣品的兩級庫存管理。對于不易發(fā)現的污染源，最好定期進(jìn)行檢測，主要是支原體污染和細胞交叉污染。

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