1.準備工作：

根據培養細胞的特性，提前準備好適合的培養基和血清等。最好沿用細胞原來(lái)的培養條件，以免細胞在新環(huán)境下還需要過(guò)渡適應。同時(shí)，充分了解到細胞的生長(cháng)特性和形態(tài)特征，便于后續的培養觀(guān)察。

2.貼壁細胞傳代：

1）移棄使用過(guò)的細胞培養液。（不要直接倒掉，避免瓶口殘留導致易污染）

2）使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（PBS）沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細胞層，前后搖晃容器數次，最后移棄沖洗液。（洗去殘留的血清，避免影響胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培養瓶為例，向瓶?jì)燃尤?ml胰蛋白酶-EDTA（請根據各細胞的指引使用合適的濃度）消化液，輕輕搖動(dòng)培養瓶，使消化液流遍所有細胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，幾分鐘內，會(huì )發(fā)現胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，傾斜培養瓶時(shí)細胞層能自然流下，此時(shí)應加入2-3ml含血清的*培養液終止消化（細胞解離所需時(shí)間請參考各細胞的指引，并建議每隔30秒在顯微鏡下觀(guān)察細胞的解離情況）。另外，并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進(jìn)行解離，請根據各細胞的指引選擇合適的解離方法。

4）使培養瓶?jì)A斜，吸取培養瓶?jì)纫后w輕輕沖向原細胞生長(cháng)表面，重復該動(dòng)作2-3次，使所有細胞沿瓶底流下，再輕柔地把細胞吹打成單個(gè)懸液（吹打過(guò)程中應避免氣泡的產(chǎn)生）。

PS：對于難消化的細胞，盡量不要通過(guò)用力吹打的方式來(lái)處理，以免對細胞產(chǎn)生物理?yè)p傷?？梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細胞分出來(lái)，及時(shí)終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進(jìn)行再次消化。做到分層消化，避免易消化細胞長(cháng)時(shí)間在胰酶消化下受損。

5）把所有的細胞懸液轉移到15ml離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。

6）加入新的含血清*培養液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，補足新的含血清*培養液，輕輕搖晃混勻。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀(guān)察細胞的貼壁情況。

3.懸浮細胞傳代：

因懸浮生長(cháng)細胞不貼壁，故傳代時(shí)不必采用酶消化方法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。

1）直接傳代時(shí)，靜置5-10分鐘，待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培養液，補足新鮮的含血清*培養液，混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，輕輕搖晃混勻。

2）離心傳代時(shí)，將細胞連同培養液一并轉移到離心管內，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清后，加入新鮮的含血清*培養液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例，把細胞懸液均勻分到各培養器皿中，補足新鮮的含血清*培養液，輕輕搖晃混勻。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天顯微鏡下觀(guān)察細胞的情況。

4.貼壁懸浮混合型細胞傳代：

先將懸浮的細胞收集，再參考“貼壁細胞傳代"方法進(jìn)行消化收集，一起接種到培養器皿中。

PS: 懸浮細胞生長(cháng)中一般對細胞密度要求比較高，培養中最好參考指南控制好細胞密度，不能過(guò)密也不能過(guò)稀。

5.細胞凍存：

1）按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞。

2）加入細胞凍存液（一般10%DMSO+對應細胞的*培養液），使細胞的終密度為(5~10)×105個(gè)/ml，移入細胞凍存管中。

3）程序降溫（以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例）：4℃ 30min→-80℃過(guò)夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否則凍存液無(wú)法滲透到細胞，易產(chǎn)生冰晶導致細胞受損。）

6.細胞復蘇：

1）取出貯存的細胞，待液氮揮發(fā)后，馬上37℃水浴中輕輕搖動(dòng)使快速融化（通常2min內，時(shí)間長(cháng)了細胞狀態(tài)會(huì )受影響）。為避免劇烈的溫差變化導致凍存管炸裂，操作該步時(shí)請配戴防護面罩或防護目鏡。

PS：干冰運輸的凍存細胞，收到后需要立刻放入深低溫冰箱或液氮中，至少3d后再進(jìn)行復蘇操作。

2）轉移到無(wú)菌操作臺，75%酒精擦拭凍存管外部。

3）將細胞懸液轉移到裝有10-20ml經(jīng)預熱的含血清*培養液離心管中，800-1000rpm離心3-5分鐘，移棄上清。

4）重新加入經(jīng)預熱的含血清*培養液重懸細胞，以約(3~5)×105個(gè)/ml密度接種到培養器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天顯微鏡下觀(guān)察細胞的情況。

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