IPSC生成通常是實(shí)現真正的實(shí)驗目標的中間步驟。

它一般應用于：

人胚胎發(fā)育建模；

作為難以分離的細胞來(lái)源，用于基礎研究和疾病建模；

藥物篩選應用；

細胞替代治療。

IPS神經(jīng)分化的protocol，以下是神經(jīng)細胞的分化操作步驟，可供參考：

準備好神經(jīng)誘導分化的培養基，建議使用Essential 8TM培養基以Matrigel基質(zhì)膠作為基質(zhì)，或者使用StemPro hESC SFM培養基以Geltrex作為基質(zhì)。

1、高品質(zhì)的PSCs（無(wú)分化或者僅含少量分化的克?。┦沁M(jìn)行有效的神經(jīng)誘導的關(guān)鍵。在傳代PSCs時(shí)去除所有的或者大部分分化的克隆。分化的克隆可以通過(guò)使用Nikon顯微標志和Nikon顯微C-OA 15mm目標適配器被標記

2、當PSCs達到~70-80%融合時(shí)，根據PSC分種實(shí)驗方法將PSC接種到6孔板中在分種PSC團塊前，確定分種的密度，方法如下：

3、當準備好PSC細胞懸液后，取部分細胞到15-ml錐形管中來(lái)估算PSC細胞懸液的總細胞量（如，將6孔板的一個(gè)孔中的細胞制備成6ml PSC細胞懸液，鄧1ml來(lái)進(jìn)行細胞數估算）。

4、將裝有細胞的15-ml錐形管以200×g離心3分鐘，棄上清。

5、加入1ml預熱的StemPro Accutase細胞消化液，37度孵育5分鐘。

6、用1ml的移液管上下猛烈的吹吸5次，將細胞分散成單個(gè)細胞懸液。

7、選擇你常用的方法計數總細胞數。如果在1ml Accutase細胞消化液中的總細胞數為1×10^6，那么剩下的5ml PSC細胞懸液中的總細胞數為1×10^6×5=5×10^6

8、加入2.5ml PSC培養基至包被好的6孔板的每個(gè)孔中。

9、溫和的混勻有PSC細胞懸液的錐形管，將PSCs以2.5×10^6-3×10^5的數量接種到每個(gè)孔中。例如，如果PSC懸液為1×10^6個(gè)細胞/ml，將0.25-0.3ml PSC懸液加入到每個(gè)孔中。

10、快速的前后左右晃動(dòng)培養皿，將細胞分散到整個(gè)表面，于CO2培養箱中培養。

以下點(diǎn)需要注意：

1、分種 的比例根據在分種前PSCs的融合程度用PSC細胞系類(lèi)型的不同而有所差異。在分種后的第一天即開(kāi)始進(jìn)行神經(jīng)誘導（大約傳代后24小時(shí)）。在傳代PSCs時(shí)，PSCs的起始密度應該在15-25%的融合細胞需要以團塊狀接種，避免成為單個(gè)細胞。單個(gè)細胞接種PSC易增加細胞的死亡。

2、在分種的時(shí)候可以將10um ROCK抑制劑加入到PSC培養基中處理過(guò)夜，以防止細胞的死亡。

3、如果起始用的PCS狀態(tài)很差，非神經(jīng)樣的克隆將會(huì )在培養中出現。在這種情況下，可以有兩種操作選擇：

a、如果僅在培養皿的極少區域出現該細胞形態(tài)，在挑除非神經(jīng)樣分化的克隆后可以繼續培養。為了去除非神經(jīng)樣分化的克隆，先用顯微標記出所有非神經(jīng)樣分化的克隆。傾斜培養皿，用巴氏玻璃吸管將標記的克隆吸掉去除。將培養皿旋轉180度，重復以上步驟。操作每個(gè)孔時(shí)均重復以上步驟，以避免細胞缺少培養基而需經(jīng)受無(wú)培養基壓力。

b、如果出現了大量的非神經(jīng)樣的克隆，建議放棄繼續培養，而選擇高品質(zhì)的PSCs重頭開(kāi)始。

c、更換培養基一定要注意，請預熱*培養基，冰冷的培養基加入會(huì )導致細胞皺縮和漂浮。

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