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    細胞的必須檢查,你有做過(guò)嗎?

    發(fā)布時(shí)間: 2022-01-04  點(diǎn)擊次數: 928次

    文章描述了一個(gè)典型的工作流程,與細胞操作需要注意的必要步驟,為了成功地應用哺乳動(dòng)物細胞系,它們必須在受控的條件下生長(cháng),并需要自己特定的生長(cháng)介質(zhì)。此外,為了保證一致性,必須定期監測它們的生長(cháng)情況。當細胞系達到約80%的合流時(shí),必須傳代培養,以確保細胞的正常生長(cháng)和健康。80%的重合性是指培養容器表面的80%被細胞覆蓋。



    01

    為什么我需要傳代我的細胞?                      


    細胞培養一旦開(kāi)始,由于細胞數量的增加、營(yíng)養物質(zhì)的消耗和有毒代謝物的增加,它不能無(wú)限期地生長(cháng),最終導致細胞死亡。此外,研究人員通常對細胞要進(jìn)行多次實(shí)驗,因此不希望一次用完所有的細胞。傳代或分裂細胞,通過(guò)去除培養基和轉移細胞到新鮮的生長(cháng)培養基,細胞被給予新鮮的營(yíng)養同事有毒的代謝物也被去除,細胞就會(huì )被賦予新的活力繼續生長(cháng)。



    02

    細胞生長(cháng)曲線(xiàn)                                            



    細胞在培養液中的生長(cháng)曲線(xiàn)由四個(gè)階段組成:生長(cháng)開(kāi)始前的潛伏期(滯后期),指數生長(cháng)期(對數期),細胞數量快速增長(cháng)逐漸放緩的平穩期和細胞死亡的死亡期,這是因為缺乏營(yíng)養和錯誤的生存條件。在對數期應更換培養基,細胞在到達固定期前應進(jìn)行傳代,如圖1.


    圖一


    所以培養細胞的同學(xué)請注意:

    為了保持細胞的健康和積極生長(cháng),有必要更新生長(cháng)培養基,并定期傳代。根據細胞類(lèi)型的不同,培養基在對數期可以發(fā)生幾次改變。傳代細胞的最佳時(shí)間是在對數期和固定期之間,即細胞達到合流之前。

     


    一. 為什么用胰酶傳代細胞?


    準備細胞進(jìn)行傳代培養的最常見(jiàn)方法是用胰蛋白酶等蛋白水解酶破壞細胞間的細胞與底物的連接。胰蛋白酶與乙二胺四乙酸(EDTA)結合會(huì )導致細胞從生長(cháng)表面脫離。胰蛋白酶切斷將細胞固定在培養皿上的局部粘連,EDTA作為鈣螯合劑。

     

    通過(guò)去除鈣,參與細胞間相互作用的鈣粘蛋白被破壞,細胞彼此分離。一旦從生長(cháng)表面和周?chē)毎蛛x,就可以很容易地分離并在新的細胞培養皿中生長(cháng)。

      

    細胞培養條件和傳代培養方法因細胞類(lèi)型而異。圖2描述了細胞培養過(guò)程中的基本步驟。在整個(gè)培養過(guò)程中,在一個(gè)無(wú)污染的環(huán)境中工作是很重要的。在開(kāi)始、胰蛋白酶化、細胞計數和分裂后都要檢查細胞。為了取得一致的結果,保持良好的記錄和文件也很重要。

    圖二


    二. 3個(gè)步驟確定細胞是否能夠傳代

    ①. 將細胞從培養箱中取出,置于顯微鏡下進(jìn)行快速細胞檢查。細胞應該每天在顯微鏡下檢查,以確保它們是健康的(沒(méi)有污染,很少死細胞)和生長(cháng)如預期。

    ②. 細胞應主要附著(zhù)在培養皿或燒瓶的底部,而培養基應是粉橘色。pH值指示物酚紅在酸化時(shí)變成黃色,這個(gè)時(shí)候需要注意了 ,有兩種情況 一是細胞的密度過(guò)大,已經(jīng)到了生長(cháng)平頂期,二是細胞里有污染物。

    ③. 用顯微鏡拍照,記錄好細胞狀態(tài)對于保證實(shí)驗結果的一致性非常重要。



    三. 傳代我的細胞

    ①. 移液器將培養基從細胞皿移到廢物容器中。用5ml不含鈣和鎂的預加熱PBS仔細清洗細胞多達三次,以去除殘留培養基中的胎牛血清(FBS)。胎牛血清會(huì )抑制胰蛋白酶。

    ②. 加入相應規格的預溫胰蛋白酶/EDTA ,比如:T25瓶 1-2ml左右,輕輕旋轉以覆蓋培養皿底部的所有細胞。

    ③. 將細胞在37°C孵育2-3分鐘或者室溫3-5分鐘使其分離。不同的細胞系需要不同的胰蛋白酶孵育時(shí)間。為避免過(guò)度胰蛋白酶作用損傷細胞,每隔2分鐘在顯微鏡下檢查一次。待細胞變得橢圓透亮后,caco-2/hepG2細胞邊緣開(kāi)始漂浮時(shí),加雙倍以上*培養基中和,將細胞懸浮液轉移到15ml的試管中,并以1000轉/分旋轉5min。

    ④. 抽吸上清,加2ml*培養基重懸細胞,分瓶或者凍存。





    四. 細胞計數:


    ①. 將100µL細胞懸液與等量的0.4%臺盼藍溶液混合。臺盼藍可以選擇性地穿透死細胞的細胞膜并將其染成藍色,但不會(huì )被活細胞吸收。將蓋片置于計數面上,準備血細胞計。

    ②. 將移液管尖的一端置于蓋玻片邊緣,將細胞懸浮液裝入計數室(每個(gè)計數面積約為4µl),輕輕排出細胞懸浮液。蓋層下的區域通過(guò)毛細作用而淤塞。在大多數情況下,腔室有兩個(gè)計數區,可以獨立加載。

    ③. 將腔室置于顯微鏡臺上,聚焦細胞。計數柵的方形圖案因腔體類(lèi)型的不同而不同。你在這里看到的??怂?羅森塔爾計數室有16個(gè)面積為一平方毫米的區域,每個(gè)區域由三道線(xiàn)圍成。每個(gè)方塊又被分成16個(gè)更小的方塊。計算一個(gè)16平方區域中的所有單元格,如圖所示。為了避免在區域的邊緣計算兩次單元格,只計算正方形兩邊直線(xiàn)上的那些單元格。在本例中,應計算觸及左上界限的單元格(較粗的紅線(xiàn))。細胞觸及的下限值和右限值不應被考慮在內。將活細胞和死細胞按5個(gè)一平方毫米的矩形計數。為了進(jìn)行計算,您需要將所有5個(gè)正方形的計數結果結合起來(lái)。為了提高測量精度,還可以計算計數室的額外平方.


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