材料與儀器

貼壁細胞 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標記培養基
100 mm 組織培養皿 配有液體同位素垃圾閥門(mén)的真空吸氣器

步驟

1. 在 100 mm 組織培養皿中培養細胞到 80%~90% 融合（0.5 × 107~2 × 107 細胞，取決于細胞類(lèi)型）。

2. 如上所述制備 [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見(jiàn)基本方案步驟 1）。

3. 吸棄上清并用 10 ml 預熱（37℃）脈沖標記培養基輕柔洗細胞 2 次，棄掉洗液。

4. 加 5 ml 預熱脈沖標記培養基，在潮濕、37℃、5% CO2 培養箱內孵育 15 min，以除去細胞內的甲硫氨酸。

5. 棄掉細胞上的培養基，加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液體（見(jiàn)步驟 2），在 CO2 培養箱內孵育 10~30 min。

6. 棄掉細胞上的培養基。用 10 ml 冷凍的 PBS 洗細胞并棄掉 PBS。加 10 ml 冷凍的 PBS，并用塑料刮子或橡膠細胞刮小心刮取收集細胞。

7. 轉移懸液到 15 ml 離心管中，4℃，300 g 離心 5 min，棄上清。如果在標記過(guò)程中細胞明顯脫落，有必要將含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的細胞小心刮取，并將懸液轉移到 15 ml 離心管中，在用 PBS 洗滌前離心。

8. 可選：通過(guò) TCA 沉淀法測定標記摻入的量（見(jiàn)輔助方案）。

注意事項

如果在標記過(guò)程中細胞明顯脫落，有必要將含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的細胞小心刮取， 并將懸液轉移到15 ml離心管中，在用PBS洗滌前離心。

常見(jiàn)問(wèn)題

１. 實(shí)驗材料中貼壁細胞，如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1，或原代培養的成纖維細胞或內皮細胞。

２. 如果細胞沉淀不馬上使用的話(huà)，見(jiàn)基本方案步驟7。

同實(shí)驗其他方法