材料與儀器

細胞懸液／貼壁細胞 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 示蹤培養基
配有液體同位素垃圾閥門(mén)的真空吸氣器

步驟

1. 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)和每個(gè)樣品準備 0.5 × 107 ~2 × 107 細胞， 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 細胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脈沖標記 10~30 min （見(jiàn)基本方案步驟 1~4，或見(jiàn)備擇方案 1 步驟 1~5）。

2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液，用 10 ml 37℃ 的示蹤培養基洗一次，并加入 10 ml 37℃ 的示蹤培養基。

3. 37℃ 培養到預期時(shí)間。擰緊試管蓋子在旋轉情況下培養細胞懸液。在 032 培養箱里孵育貼壁細胞。

4. 刮取貼壁細胞并轉移到 15 ml 離心管。收集刮取的細胞或細胞懸浮液于 4℃ 300 g 離心 5 min。

5. 可選：通過(guò) TCA 沉淀法測定標記摻入的量（見(jiàn)輔助方案）。

注意事項

1. 將2倍體積含有過(guò)量未標記甲硫氨酸（15mg/L）的示蹤培養基直接加入到標記混合物中，能夠快速終止標記反應。

2. 示蹤≤2 h，細胞懸液的最終濃度應該是 2 × 106 細胞/ml，或示蹤>2 h，用 0.5 × 106 細胞/ml。 對貼壁細胞而言，加 10 ml/100 mm 平皿。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 上清可以棄掉，也可以收集起來(lái)用于分析分泌或脫落到培養基中的蛋白質(zhì)。

2. 如果細胞沉淀不馬上使用的話(huà)，見(jiàn)基本方案步驟7。

同實(shí)驗其他方法