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    細胞培養常遇到的問(wèn)題解決辦法

    發(fā)布時(shí)間: 2022-10-24  點(diǎn)擊次數: 1014次

    養細胞是一件勞心勞力的事。要像照顧小孩一樣仔細對待,愛(ài)護它,呵護它。這次就來(lái)講講細胞培養常見(jiàn)問(wèn)題的原因及解決辦法。




    1 培養液 pH 值變化太快


     原因:


    • CO2 張力不對

    • 培養瓶蓋擰得太緊

    • NaHCO3 緩沖系統緩沖力不足

    • 培養液中鹽濃度不正確

    • 細菌、酵母或真菌污染


     解決辦法:


    • 按培養液中 NaHCO3 濃度增加或減少培養箱內 CO2 濃度,2.0 g/L 到 3.7 g/L 濃度 NaHCO3 對應 CO2 濃度為 5% 到 10%?;蛘吒挠貌灰蕾?lài) CO2 培養液

    • 松開(kāi)瓶蓋 1/4 圈

    • 加 HEPES 緩沖液至 10 到 25 mM 終濃度

    • 在 CO2 培養環(huán)境中改用基于 Earle’s 鹽配制的培養液,在大氣培養環(huán)境中培養改用 Hank’s 鹽配制的培養液

    • 丟棄培養物或用抗生素除菌





    2 培養液出現沉淀,pH 值不變


    原因:


    • 用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養基成分沉淀下來(lái)

    • 冰凍保存培養液


    解決辦法:


    • 用去離子水反復沖洗玻璃器皿,然后除菌

    • 將培養液加熱到 37 ℃,搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在,丟棄培養液





    3 培養液出現沉淀,同時(shí) pH 發(fā)生變化


    原因:


    • 細菌或真菌污染


    解決辦法:


    • 丟棄培養物或用抗生素除菌




    4 培養細胞不貼壁


     原因:


    • 胰蛋白酶消化過(guò)度

    • 支原體污染

    • 培養液中無(wú)貼壁因子


    解決辦法:


    • 縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度

    • 分離培養物,檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發(fā)現支原體污染,丟棄培養物

    • 改變培養液成分


    5 懸浮細胞成簇




    原因:



    • 培養液中含鈣、鎂離子

    • 支原體污染

    • 蛋白酶過(guò)度消化使得細胞裂解釋放 DNA



    解決辦法:



    • 用無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞,輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液

    • 分離培養物,檢測支原體。如發(fā)現支原體污染,丟棄培養物

    • 用 DNase I 處理細胞



    6 原代細胞培養物污染




    原因:



    • 原代培養組織在進(jìn)入培養前已污染



    解決辦法:



    • 培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織



    7 培養細胞死亡


    原因:


    • 培養箱內無(wú) CO2

    • 培養箱內溫度波動(dòng)太大

    • 細胞凍存或復蘇過(guò)程中損傷

    • 培養液滲透壓不正確

    • 培養液種有毒代謝產(chǎn)物堆積


    解決辦法:


    • 檢測培養箱內 CO2

    • 檢查培養箱內溫度

    • 取新的保存細胞種

    • 檢測培養液滲透壓。注意:大多數哺乳動(dòng)物細胞能耐受滲透壓為 260~350 mOsm/kg。加入額外試劑如 HEPES 或藥物都有可能影響培養液滲透壓。

    • 換入新鮮培養液


    8 培養細胞生長(cháng)減慢




     原因:



    • 由于更換不同培養液或血清

    • 培養液中一些細胞生長(cháng)必需成分如谷氨酰胺或生長(cháng)因子耗盡或缺乏或已被破壞

    • 培養物中有少量細菌或真菌污染

    • 試劑保存不當

    • 接種細胞起始濃度太低,細胞已老化

    • 支原體污染



    解決辦法:



    • 比較新培養液與原培養液成分,比較新血清與舊血清支持細胞生長(cháng)實(shí)驗。讓細胞逐漸適應新培養液

    • 換入新鮮配制培養液。補加谷氨酰胺或生長(cháng)因子

    • 用無(wú)抗生素培養液培養,如發(fā)現污染,丟棄培養物?;蛴每股爻?/p>

    • 血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培養液需在 2~8 ℃ 避光保存。含血清*培養液在 2~8 ℃ 保存,并在 2 周內用完

    • 增加接種細胞起始濃度,換用新的保種細胞

    • 分離培養物,檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發(fā)現支原體污染,丟棄培養物




    9 保存血清最合適的方法是?


    建議血清應保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而,若存放于 4 ℃ 時(shí),請勿超過(guò)一個(gè)月。若您一次無(wú)法用完一瓶,建議您無(wú)菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。





    10 如何解凍血清不會(huì )使其質(zhì)量受損?


    建議將血清從冷凍箱取出后,先置于 2~8 ℃ 冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過(guò)程中必須規則地搖晃均勻。



    11 血清解凍后有絮狀沉淀物怎么辦?


    血清中沉淀物的出現有許多種原因,但最為普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會(huì )存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。


    但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內,以 400 g 稍微離心,上清液即可接著(zhù)加入培養基內一起過(guò)濾。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會(huì )阻塞您的過(guò)濾膜。





    12 為什么要熱滅活血清?


    加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué)研究,培養 ES 細胞,昆蟲(chóng)細胞和平滑肌細胞時(shí),推薦使用熱滅活血清。



    13 有必要做熱滅活嗎?



    實(shí)驗顯示,經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過(guò)的血清對細胞的生長(cháng)只有微小的促進(jìn),或*沒(méi)有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量,而造成細胞生長(cháng)速率的降低。


    而經(jīng)過(guò)熱處理的血清,沉淀物的形成會(huì )顯著(zhù)的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀(guān)察,像是「小黑點(diǎn)」,常常會(huì )讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在 37 ℃ 環(huán)境中,又會(huì )使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。




    14 儲存冰箱中的胎牛血清出現沉淀?



    GIBICO 的胎牛血清沒(méi)有預老化,儲存在 2~8 ℃ 時(shí),血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見(jiàn)的混濁。這應該不會(huì )影響血清的質(zhì)量。推薦在 -20 ℃ 儲存胎牛血清,避免反復凍融。




    15 如何避免沉淀物的產(chǎn)生?


    解凍血清時(shí),請按照所建議的逐步解凍法(-20 ℃ 至 4 ℃ 至室溫),若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如 -20 ℃ 至 37 ℃),實(shí)驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。


    解凍血清時(shí),請隨時(shí)將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發(fā)生。


    請勿將血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久,血清會(huì )變得混濁,同時(shí)血清中許多較不穩定的成分也會(huì )因此受到損害,而影響血清的質(zhì)量。


    血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無(wú)須做此步驟。若必須做血清的熱滅活,請遵守 56 ℃,30 分鐘的原則,并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高,時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻,都會(huì )造成沉淀物的增多。



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