一、細胞培養的基本概念

（1）基本概念

細胞培養：狹義的細胞培養主要是指分離（散）細胞培養，廣義的細胞培養還包括單（個(gè)）細胞培養又稱(chēng)克?。╟lone），是指單個(gè)細胞通過(guò)有絲分裂形成的細胞群體。一個(gè)細胞克隆中的所有細胞均來(lái)源于同一個(gè)祖先細胞。

原代培養：即第一次培養，指將培養物放在體外生長(cháng)環(huán)境中持續培養，中途不分割培養物的培養過(guò)程。

傳代：原代培養成功后，隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸發(fā)生接觸性抑制，生長(cháng)速度減慢甚至停止；另一方面因營(yíng)養物不足和代謝物積累不利于生長(cháng)或發(fā)生中毒。需要將培養物分割成小的部分，重新接種到另外的培養器皿（瓶）內，再進(jìn)行培養。這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為傳代或者再培養。

細胞系：原代培養物經(jīng)首傳代成功后，即成細胞系。如細胞系不能繼續傳代或傳代數有限，稱(chēng)為有限細胞系，它由原代培養中的許多細胞系列組成。如細胞系可連續傳代，則稱(chēng)為連續細胞系，即已建成的細胞系。

細胞株：通過(guò)篩選或克隆化，且有特殊性質(zhì)或特異標記的細胞。這些特性在以后的培養中必須持續存在。這些特性包括具有一定的標記染色體，對某種病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。 

三、常用的器材與試劑

（1）常用儀器

超凈工作臺：為細胞操作提供無(wú)菌環(huán)境。紫外燈：紫外線(xiàn)消毒。主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒。

濾器：過(guò)濾除菌：大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌。

電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2h）。主要用干玻璃器皿消毒。

壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣。

CO2培養箱:CO2培養箱設定的條件:37℃，5%CO2。使用CO2培養箱培養細胞時(shí)應注意的問(wèn)題：

①用螺旋口瓶培養細胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。

②保持培養箱內空氣干凈。定期消毒（90℃，14h）。

③箱內火菌蒸餾水 3000ml 蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避兔培養液蒸發(fā)。

其它儀器：倒置顯微鏡，酶標儀，微孔板震蕩器，液氮罐，自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀等。

（2）常用耗材

耗材：培養瓶，吸管，培養板，凍存管，酒精燈

（3）常用試劑

• 消化液

胰蛋白酶：是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制，常用的胰蛋白酶液濃度是0.25%。用濾器過(guò)濾除菌，如經(jīng)費充?？梢灾苯淤徺I(mǎi)已經(jīng)配制好的胰酶，無(wú)需自己配制。

胰蛋白酶作用機制：胰蛋白酶作用于與賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過(guò)一定限度會(huì )損傷細胞。

胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10 min?？捎煤迮囵B液終止其對細胞的消化作用。

• 培養基

培養基（培養液）：是維持體外細胞生存和生長(cháng)的溶液，分天然培養基和合成培養基。

天然培養基：天然培養基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養成分豐富，培養效果好。缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復雜，影響對某些實(shí)驗產(chǎn)物的提取和實(shí)驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染。

合成培養基：合成培養基是根據細胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能全滿(mǎn)足體外細胞生長(cháng)需要，只能維持細胞生存，要想使細胞生長(cháng)和繁殖，還需補充一定量的天然培養基（如血清）。

• 血清培養基

血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(cháng)因子⑥轉移蛋白⑦不明成分。

常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量為好。

血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗成敗的關(guān)鍵，優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30min。血清的消毒：過(guò)濾除菌。

• 抗菌素的使用

抗生素的作用：在培養液配制后，培養液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長(cháng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素最終使用濃度為每毫升100單位，方便、廣譜、穩定。

• 完培的組成

基礎培養基80%一95%，血清5%-20%，碳酸氫鈉2.0g/L，青、鏈霉素各100單位/毫升。

四、細胞的傳代方式

（1）懸浮細胞

直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養液去除l/2-2/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。

離心法傳代：離心（1000 r/min）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。

（2）半懸浮細胞

此類(lèi)細胞部分呈現貼壁生長(cháng)現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。

（3）貼壁細胞

采用酶消化法傳代，常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

詳細步驟:

1、吸光培養瓶中的培養基，加入1-2ml PBS清洗2-3遍，吸出PBS。

2、加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液，以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準。

3、靜置2-10min（具體時(shí)間根據細胞狀態(tài)確定），顯微鏡下動(dòng)態(tài)監測，當細胞消化全，立即加入含血清培養基，終止消化。

4、轉移至離心管，離心（800r/min，5min）。

5、吸去胰蛋白酶液，加入培養液，反復吹打細胞沉淀，混勻，形成細胞懸液。

6、吸取適量細胞懸液，接種于新的培養瓶?jì)取?/p>

7、加適量新鮮培養液于接種了細胞懸液的新培養瓶?jì)?，然后放入培養箱中培養。

五、細胞的凍存與復蘇

（1）凍存和復蘇的原則

慢凍快融，當細胞冷到0℃以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會(huì )造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過(guò)程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。

（2）慢凍程序

方法一：當溫度在-25℃以上時(shí)，-1~-2℃/min；當溫度達-25℃以下時(shí)，-5~-10℃/min；當溫度達-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細胞凍存。

方法二：冷凍管置于已設定程序之程序降溫機中每分鐘降-1～-3℃至-80℃以下，再放入液氮長(cháng)期保存。

方法三：購買(mǎi)無(wú)血清快速細胞凍存液，可以省掉程序降溫的步驟，直接凍存。補充：一般凍存液的配置：90%血清+10%DMSO。

（3）基低溫保護劑的應用

在細胞凍存時(shí)加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結過(guò)程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

（4）細胞凍存步驟

1、預先配制凍存液：含20%血清培養基10%DMSO

2、取對數生長(cháng)期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jì)龃嬉?，用吸管吹打制成細胞懸液?×106~5×106細胞/ml）

3、加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱(chēng)和冷凍日期。

4、按照慢凍程序對細胞進(jìn)行凍存。

（5）細胞復蘇步驟

1、從液氮中取出冷凍管，迅速投入37℃水浴鍋，使其融化（1分鐘左右）。

2、立即轉移至離心管，加入適量培養液。

3、以800r/min離心5分鐘。

4、去上清，加新鮮培養液，吹打混勻成細胞懸液，轉移至培養瓶，放入培養箱培養。

六、細胞計數

（1）人工計數法

吹打待測細胞懸液中細胞，使其在懸液內分布均勻，這樣只需測定很小一部分體積的細胞懸液中的細胞數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。

酒精消毒計數板：用酒精棉將細胞計數板和蓋玻片全擦拭干凈，并將蓋玻片蓋于細胞計數板上；

轉移蓋玻片：吸取10 ul單細胞懸液，并沿著(zhù)蓋玻片邊緣滴加，使細胞懸液填滿(mǎn)蓋玻片和計數板之間區域，注意避免產(chǎn)生氣泡，細胞懸液亦不能流入計數板的邊槽中，之后靜置3 min；

數細胞：隨機選取計數板上其中4大格并記錄4大格中的細胞總數，壓線(xiàn)的細胞按照數上不數下，數左不數右的原則，之后按照以下公式進(jìn)行計算：

細胞數／mL=4大格細胞總數／4×104×稀釋倍數

七、注意事項

（1）注意事項

計數前：計數前，注意吸盡培養皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個(gè)細胞。

實(shí)驗操作臺：實(shí)驗操作應在操作臺中央無(wú)菌區域內進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區域操作。

吸管：吸取過(guò)營(yíng)養液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營(yíng)養液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì )把有害物帶入營(yíng)養液中。

手：不能用手觸及已消毒器皿瓶口、瓶塞內部，吸管前部等所有可能與細胞接觸的部分，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

火焰滅菌時(shí)間：開(kāi)啟、關(guān)閉長(cháng)有細胞的培養瓶時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短。防止因溫度過(guò)高燒死細胞。

換液：換液時(shí)傾倒廢液，瓶口不能接觸廢液缸，速度不能過(guò)快，防止廢液四濺。

吹打細胞：吹打細胞時(shí)，要注意邊角的細胞是否吹打下來(lái)。

相對較臟的物品:手或相對較臟的物品不能經(jīng)過(guò)開(kāi)放的瓶口上，即不可以在開(kāi)放容器上方操作。

交叉污染:每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。

自身的安全:注意自身的安全，對于來(lái)自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過(guò)程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如DMSO，并避免尖銳物品傷人等。

凍存:從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但最好為對數生長(cháng)期細胞。在凍存前一天最好換一次培養液。將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護工作，以免凍傷。凍存和復蘇最好用新配制的培養液。

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