原理

收集胚胎，除去絨毛膜，用胰蛋白酶分散胚胎細胞，然后在胚胎成纖維細胞飼養層上培養從斑馬魚(yú)囊胚和原腸期胚獲得的原代細胞。

材料與儀器

步驟

鱒魚(yú)胚胎提取物：

(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚(yú)種系，在 10°C 條件下飼養，或者受精后 3 天的斑馬魚(yú)，在 28°C 條件下飼養），在 -80°C 條件下凍存

(b)為了制備提取物，將約 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 勻漿器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min

(c)將勻漿通過(guò)數層紗布過(guò)濾后去除絨毛膜，然后在 4°C 條件下離心（20000 g，30 min )

(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層

(e)將上清液移入 1 只新離心管，按操作步驟（c ) 離心

(f)收集上清液，留下剩余的脂質(zhì)，然后在 4°C 條件下超速離心（100000 g，60 min )

(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液，然后過(guò)濾除菌

(h)提取物過(guò)一系列濾器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過(guò)濾

(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后，在 -80°C 條件下凍存

(j)為了用提取物培養細胞，測量蛋白質(zhì)濃度（見(jiàn)方案 21.4 )，然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度

(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏，最長(cháng) 2 個(gè)月

BRL 細胞條件培養液：

(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培養液培養 BRL 細胞（ATCC )

(b)當細胞匯合時(shí)，用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養液，在 37°C 條件下培養

(c)5 天后吸出 LDF，過(guò)濾，在 -20°C 凍存

(d)向細胞中加入新鮮的 LDF，5 天后重復此過(guò)程。條件化的 LDF 培養液可從同一個(gè)培養瓶中收集 3 次。然后，將細胞分開(kāi)培養，使細胞再次匯合

1. 在中襄胚或早原腸胚期收集胚胎，用清潔水浸洗數次。

2. 浸洗后將胚胎移入 60 mm 皮氏皿 ( 50~100 個(gè)/皿）。然后，將皮氏皿放入層流通風(fēng)櫥中，在無(wú)菌條件下放置。

3. 將胚胎放入稀漂白劑中浸泡 2 min，然后用無(wú)菌的 Holtfreter 緩沖液浸洗數次。

4. 用 2 ml 鏈酶蛋白酶 E 溶液孵育 10 min，使胚胎去絨毛膜。然后，將胚胎在皮氏皿中輕輕攪動(dòng)，使胚胎與部分消化的絨毛膜分離。

5. 將培養皿傾斜，以便從一側收集胚胎，用巴斯德吸管輕輕吸出 1.5 ml 鏈酶蛋白酶溶液。為了防止去絨毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂，保持皮氏皿傾斜，以便胚胎懸浮在剩余的鏈酶蛋白酶溶液中。

6. 加入 2 ml Holtfreter 緩沖液，輕輕攪動(dòng)，以便輕輕浸洗胚胎。

7. 將皮氏皿傾斜，吸去大部分 Holtfreter 緩沖液，將胚胎懸浮在約 0.5 ml 緩沖液中。

8. 重復浸洗步驟兩次以上。

9. 在最后 1 次浸洗后，將胚胎懸浮在 0.5 ml Holtfreter 緩沖液中，然后加入 2 ml 胰蛋白酶溶液。

10. 用胰蛋白酶將胚胎孵育 1 min，然后通過(guò)用吸管輕輕吹打 3~4 次分離細胞。

11. 將細胞懸液立即移入無(wú)菌的聚丙烯離心管中，然后加入 200 μl FBS，以終止胰蛋白酶的消化作用。

12. 通過(guò)離心（500 g， 5 min ) 收集細胞，然后用無(wú) FBS 或鱒魚(yú)血清的 LDF 原代培養液混懸細胞。

13. 將細胞以 1×104 個(gè)/cm2 的細胞密度種植到含有生長(cháng)抑制的成纖維細胞飼養層的多孔培養板或培養瓶中。

14. 在加入 FBS 或鱒魚(yú)血清前讓細胞附著(zhù)于飼養層（約 15 min )。在培養液中使用 10 ng/ml 人重組 LIF，此優(yōu)于 BRL 條件培養液 [Sun et al.，1995a，1995b ]。

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