原理：

人類(lèi)多能干細胞(HPSCs)具有自我更新能力，但在體外對環(huán)境擾動(dòng)高度敏感，這對其治療應用構成了挑戰。迫切需要進(jìn)一步的突破，以確保這些細胞安全和穩健的長(cháng)期生長(cháng)和功能分化。在這里，通過(guò)高通量篩選策略來(lái)確定一種小分子混合物，它可以提高hPSCs及其分化后代的生存能力。Chroman 1、Emricasan、Polyamines和trans-ISRIB(CEPT)的組合通過(guò)同時(shí)阻斷幾種原本損害細胞結構和功能的應激機制，提高了遺傳穩定的hPSCs的細胞存活率。CEPT為干細胞研究中的幾個(gè)關(guān)鍵應用提供了有力的改進(jìn)，包括常規細胞傳代、多能干細胞和分化細胞的冷凍保存、類(lèi)胚體(EB)和類(lèi)器官形成、單細胞克隆和基因組編輯。因此，CEPT代表了一種綜合細胞保護的多藥理學(xué)策略，為高效和安全地利用hPSCs提供了理論基礎。

材料與儀器：

人類(lèi)多能干細胞(HPSCs),二甲基亞砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT，超低吸附（ULA）板

步驟：

1.分離hESCs

2.在二甲基亞砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT存在下將其接種到超低吸附（ULA）板中。

實(shí)驗結果：

分離hESCs，并在二甲基亞砜、Y-27632、Chroman 1或CEPT存在下將其接種到超低吸附(ULA)板中。24小時(shí)后，觀(guān)察到顯著(zhù)的差異，因為CEPT不僅產(chǎn)生了最多數量的EBS，而且這些培養物幾乎沒(méi)有細胞碎片(圖a)。細胞存活率的顯著(zhù)改善在更可控的條件下得到進(jìn)一步證實(shí)，即在執行細胞計數后在單個(gè)井中產(chǎn)生單個(gè)EBS。與Y-27632(圖e)相比，暴露于CEPT 24小時(shí)產(chǎn)生了更大的EBs(圖b，c)，最大限度地減少了細胞死亡(圖d)，并提高了細胞存活率242%。在用CEPT啟動(dòng)的EBs中觀(guān)察到了超過(guò)7天的強勁和持續的細胞生長(cháng)，但用Y-27632(圖e)沒(méi)有觀(guān)察到。因此，在這些條件下，CEPT處理更可靠地產(chǎn)生能夠多譜系分化的EBs(圖f)。

第30天HE染色的組織學(xué)分析顯示神經(jīng)組織分化有顯著(zhù)差異(圖g)。前腦標記FOXG1的免疫組織化學(xué)證實(shí)，使用CEPT產(chǎn)生的有機化合物產(chǎn)生了更多的神經(jīng)組織，顯示出復雜的形態(tài)(圖h)。與Y-27632相比，CEPT產(chǎn)生的有機體神經(jīng)分化的改善也被使用大量可獲得的核糖核酸測序(rna-seq)數據進(jìn)行的無(wú)偏見(jiàn)轉錄分析所證實(shí)。對熱門(mén)類(lèi)別的比較表明，CEPT產(chǎn)生的有機物具有更好的神經(jīng)分化，而Y-27632處理導致神經(jīng)和非神經(jīng)類(lèi)別，如腎臟、血液和樹(shù)突狀細胞(圖i)。當Y-27632再次被CEPT取代時(shí)，觀(guān)察到改善了腎臟類(lèi)器官的形成。

與Y-27632(圖a-c)相比，解凍后的冷凍保存的hESCs(WA09)在CEPT處理24小時(shí)后存活率顯著(zhù)改善(約300%)。為了進(jìn)行更系統的比較，使用了不同的試劑組合來(lái)進(jìn)行細胞的冷凍保存和解凍(圖d-g)。有趣的是，使用三種不同的冷凍保存方法(Y-27632、CEPT和商業(yè)上可用的mFreSR)影響很小，結果相似，而在解凍期間使用的試劑產(chǎn)生了很大的差異(圖d)。因此，在CEPT、Y-27632、Revitacell、Clone或SMC4存在下，所有五個(gè)hPSC株系在CEPT存在下顯示出比DMSO、Y-27632、Revitacell、Clone或SMC4更高的存活率(圖e-g)。此外，由于生物樣本庫對再生醫學(xué)至關(guān)重要，也證實(shí)CEPT治療在長(cháng)期儲存(用CEPT冷凍保存12個(gè)月)以及hESCs、IPSCs和星形膠質(zhì)細胞解凍后提供了更高的細胞存活率。同樣，當長(cháng)期冷凍保存的細胞在解凍前在干冰上保存72小時(shí)以模擬干細胞產(chǎn)品的運輸時(shí)，CEPT的使用再次顯著(zhù)提高了細胞存活率。

接下來(lái)，研究了CEPT是否也可以改善冷凍保存的分化細胞的解凍。從一家商業(yè)供應商(Fujifilm CDI)獲得的幾種IPSC來(lái)源的細胞類(lèi)型，包括心肌細胞、肝細胞、運動(dòng)神經(jīng)元和內部生成的星形膠質(zhì)細胞，在CEPT治療后顯著(zhù)提高了細胞存活率(圖h)。例如，心肌細胞的結果表明與DMSO相比，存活率提高約36%，運動(dòng)神經(jīng)元的改善約63%。心肌細胞和運動(dòng)神經(jīng)元存活率的提高具有長(cháng)期的效果，在電鍍后多電極陣列測量中，有長(cháng)達14天的功能活動(dòng)增強(圖i-k)。

實(shí)驗結論：

CEPT不僅可以減少干細胞在形成EB過(guò)程中的凋亡，而且可以促進(jìn)EB和微器官的生長(cháng)和分化。同時(shí)，CEPT也可以極大的減少干細胞以及干細胞產(chǎn)品在凍存復蘇過(guò)程中的凋亡。因此，CEPT在人源干細胞的基礎研究和臨床運用中都有廣闊的運用前景。

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