在生物醫學(xué)實(shí)驗中，細胞培養是基礎中的基礎，大部分實(shí)驗只需要用到相關(guān)細胞系的培養，但對實(shí)驗動(dòng)物原代細胞的培養也是非常重要的。脾臟T細胞的分離和培養就是免疫學(xué)領(lǐng)域的一種非?；A和重要實(shí)驗方法。本文將詳細探討小鼠脾臟T細胞分離培養的關(guān)鍵步驟，幫助大家更有效地進(jìn)行實(shí)驗操作。

一、實(shí)驗目的

提取小鼠脾臟的naive CD4+ T細胞，研究某種因素對naive CD4+ T細胞或某一亞型的CD4+ T細胞增殖分化和功能狀態(tài)的影響，或者在誘導分化為CD4+ T細胞的某一亞型后做下游實(shí)驗。

二、實(shí)驗內容

小鼠脾臟naive CD4+ T細胞的分離和原代培養

三、實(shí)驗條件

動(dòng)物房超凈臺、細胞房超凈臺

四、實(shí)驗設計原理和方法

原代細胞的培養實(shí)驗中，無(wú)菌分選是關(guān)鍵。磁珠分選（MACS）和流式分選（FACS）是最經(jīng)常使用的兩種分離特定細胞的方法。

流式分選可以有以下特點(diǎn)：

1.實(shí)現單個(gè)細胞的分選

2.同時(shí)分選多種細胞

3.可以基于細胞表面標志物表達水平進(jìn)行分選

4.可以基于細胞內標志物進(jìn)行分選

5.可以分選由多個(gè)標志物復雜組合的細胞類(lèi)型

磁珠分選是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗結合，在外界磁場(chǎng)中與抗體結合的細胞被吸附而滯留在分選柱內，而缺乏該表面抗原的細胞則不能在分選柱內停留。分為陽(yáng)性分選（磁珠結合的細胞是目的細胞）和陰性分選（磁珠結合的細胞是非目的細胞）兩種分選策略。

與流式分選相比，磁珠分選更簡(jiǎn)便更快捷，是分離常見(jiàn)細胞類(lèi)型的第一選擇。在樣本量較大或分選稀有細胞類(lèi)型時(shí)，先磁珠分選后流式分選的方案能夠顯著(zhù)提高分選的效率。

五、實(shí)驗材料

（一）10cm培養皿、PBS、75%酒精、24孔板、手術(shù)器械（兩套）

（二）STEMCELL磁珠分選儀器、磁珠分選磁力架、分選柱、70um細胞濾網(wǎng)、裂紅液

六、實(shí)驗步驟

（一）取脾（動(dòng)物房超凈臺）

1.將小鼠脫頸處死，用75%酒精浸泡一分鐘后放入10cm培養皿中準備解剖，使用不同的小鼠品系可能會(huì )影響產(chǎn)量和性能。例如，來(lái)自C57BL/6小鼠的細胞更好地產(chǎn)生Th1細胞，而來(lái)自Balb.c小鼠的細胞更好地產(chǎn)生Th2細胞。；

2.第一套器械用于剪開(kāi)分離皮膚肌肉，暴露出足夠的視野時(shí)，換用第二套器械用于取脾。之后處理每一只小鼠時(shí)，第一套和第二套器械都不要混用；

3.取出的脾放入裝著(zhù)PBS的24孔板中。

（二）制備單細胞懸液（細胞房超凈臺）

1.將脾臟放在70um細胞濾網(wǎng)上，研磨并加入5ml PBS（一個(gè)脾臟用5ml）過(guò)濾，過(guò)濾至15ml/50ml離心管中，這一步建議過(guò)濾兩次，否則會(huì )在后續離心時(shí)形成富含纖維的沉淀，棄置此沉淀又會(huì )浪費很多細胞；

2.600g離心5min，棄上清。每個(gè)脾臟5ml/10ml裂紅液重懸，室溫裂紅5min，加入2ml/4ml PBS（與裂紅液體積對應）終止；

3.600g離心5min，棄上清。每管脾臟取1-2ml PBS重懸，從中取出100ul依次稀釋成10倍和100倍；

4.從10倍和100倍稀釋液中取出10ul放入細胞計數板，進(jìn)行計數。

（三）磁珠陽(yáng)性分選（細胞房超凈臺）

磁珠分選大致分為三個(gè)步驟：潤洗（用分選buffer潤洗分選柱）、過(guò)濾（多次重復過(guò)濾細胞懸液）、洗滌（用分選buffer洗滌柱子，使細胞洗脫）。

（四）T細胞分化培養基制備（細胞房超凈臺）

1.磁珠分選前一天（也就是Day0）準備培養板，加入250ul anti-mouse CD3（2 µg/mL或3 µg/mL，用PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育2小時(shí)或4℃過(guò)夜包被。

2.配置T細胞基礎培養基（50ml）：48.5ml的1640（血清）細胞培養基、0.5ml HEPES、0.5ml GlutaMAX、0.5ml丙酮酸鈉、50ul 2-ME；

3.重懸分裝各類(lèi)細胞因子，最終濃度為10ug/ml，于-20℃保存；

4.配置各種分化培養基（用24孔板進(jìn)行分化培養，每個(gè)孔加入1ml培養基）

（1）Th1：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul IL-12，10.3ul IL-4抗體；

（2）Th2：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul IL-4，11.5ul IFN抗體；

（3）Treg：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，10ul TGF-β；

（4）Th17：10ml基礎T細胞培養基，加入10ul IL-2，2ul TGF-β，20ul IL-6，10ul IL-1β，10.3ul IL-4抗體，11.5ul IFN抗體；

（以上培養基在4℃僅能保存一周）

5.每1ml細胞懸液（10^6個(gè)細胞）加入25ul CD3/CD28磁珠，振蕩混勻。不論任何分化體系都需要有CD3/CD28/IL-2的參與，這3者是T細胞增殖的基本功能抗體和細胞因子；

6.將分選出的naive CD4+ T細胞離心，按照你想要研究的亞型分成不同部分，用各自的分化培養基重懸，以10^6個(gè)細胞/1ml加到24孔板中培養

7.Day2.3 僅觀(guān)察；Day 4 直接在原孔中補充分化培養基；Day5 僅觀(guān)察；Day6 收取細胞，通過(guò)流式檢測分泌的細胞因子的水平，進(jìn)行后續實(shí)驗。

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