一、準備工作

1. 試劑準備：培養細胞所需的培養基、胰酶、胎牛血清（簡(jiǎn)稱(chēng)FBS）、雙抗（簡(jiǎn)稱(chēng)P/S）、PBS緩沖液等從4°C的冰箱中取出，于室溫條件下放置至恢復室溫。

2. 耗材準備：50ml離心管、15ml離心管及移液槍。

3. 實(shí)驗條件準備：打開(kāi)超凈臺紫外線(xiàn)照射30min之后通風(fēng)3-5min即可開(kāi)始實(shí)驗。

二、實(shí)驗步驟

1.潔凈要求：進(jìn)入細胞間后，穿好實(shí)驗服，戴好口罩手套等實(shí)驗裝備，將上述試劑耗材用酒精噴洗后放入超凈臺，手部同樣酒精噴洗后放入超凈臺，手部同樣酒精噴洗即可開(kāi)始。

2.試劑分裝及配制：

（1）配制（血清）細胞培養基：（血清）細胞培養基（血清占總體積10%，雙抗占總體積1%的基礎培養基混合液）一般用50ml離心管配制，減少污染的概率。即在50 ml離心管中加入5ml FBS和500μL P/S后倒入基礎培養基定容到50ml，即得50ml（血清）細胞培養基。用馬克筆在離心管壁上寫(xiě)好配制時(shí)間及溶液成分。放于一旁試劑架上備用。

（2）分裝PBS：將PBS從瓶中倒入50ml離心管中，倒PBS時(shí)注意瓶口和管口不要接觸，防止整瓶污染。標記好后也置于試劑架上備用。

3.細胞消化及傳代：

（1）細胞狀態(tài)的觀(guān)察及傳代準備：手部酒精噴洗后，將細胞培養皿或培養瓶從恒溫培養箱中取出，于倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞密度，已經(jīng)生長(cháng)到80%-90%的細胞密度即可傳代。手部再次酒精噴洗，順便將培養皿也噴一下，放入超凈臺。

（2）清洗：先用移液槍移除原有細胞培養液，更換槍頭后加入2ml PBS清洗1~2次（沿培養皿壁處加入，防止沖散貼壁細胞，加入后輕輕搖蕩，洗去殘余的培養液和懸浮的細胞），用移液槍移除PBS；注意棄掉PBS時(shí)，槍頭應在廢液缸上方，不要將槍頭伸入廢液缸中，防止回濺造成污染。

（3）消化：沿培養皿側壁加入1-2ml胰酶（能夠覆蓋細胞表面即可）消化約2-5min（水解細胞間蛋白質(zhì)，使貼壁細胞脫離附著(zhù)的底物，解離、分散細胞），在倒置顯微鏡下觀(guān)察到細胞形態(tài)由不規則逐漸皺縮為圓形即為全部消化。

（4）終止消化：加入3ml（血清）細胞培養基或將加入的胰酶棄去均可終止胰酶消化。用移液槍反復吹打培養皿皿底壁或培養瓶底壁使細胞脫離皿底壁（注意邊緣地帶和四角處，吹打力度適中，防止產(chǎn)生傷害細胞的氣泡）。

（5）離心：取吹打后的培養液轉移至15 ml離心管中，離心機1000rpm，5min得到單細胞沉淀。

（6）為節省時(shí)間，可在離心過(guò)程中準備傳代所需的培養皿（1:n傳代就準備n個(gè)培養皿），各加入9 ml（血清）細胞培養基，在皿蓋上標好培養的細胞種類(lèi)、細胞代數、傳代時(shí)間和操作人員。

（7）離心好的細胞棄上清得到單細胞沉淀，將細胞沉淀用2-3ml完整培養液重新懸浮，分n份分別加入剛剛的培養皿中，并于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細胞密度。酒精噴洗后放入恒溫培養箱培養即可。（10cm皿一皿培養基10ml；T25細胞培養瓶一瓶培養基5ml）。

4.結束操作：

（1）將所有未用完試劑的離心管用封口膜包好，同廢液缸一起拿出超凈臺。

（2）整理移液槍及耗材位置，用酒精噴濕吸水紙擦拭超凈臺，關(guān)閉超凈臺燈光。

（3）廢液倒入廢液回收瓶，廢棄耗材裝入黃色專(zhuān)用垃圾袋，等待統一回收處理。試劑放回4℃冰箱中冷藏。

（4）記錄今日實(shí)驗操作內容及結果，方便日后回顧。

三、注意事項

1、細胞消化中的注意事項

（1）消化細胞可能會(huì )由于商品化胰酶的品牌、實(shí)驗室溫度或細胞種類(lèi)等造成消化時(shí)間上的差異，建議第一次消化細胞時(shí)在加入胰酶后就轉移至倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞狀態(tài)并記錄時(shí)間。

（2）消化細胞熟練之后可以觀(guān)察到消化完成后的培養皿或培養瓶底壁呈現霧面。

（3）若5min后細胞狀態(tài)沒(méi)有明顯變化，可以將培養皿重新放回培養箱在37℃下孵育消化，或者更換別的品牌的胰酶嘗試。

（4）若消化過(guò)度則細胞會(huì )隨著(zhù)分散在胰酶中，此時(shí)棄去胰酶終止消化會(huì )造成細胞的損失，應加入含血清的培養基終止消化后離心去除。

（5）若細胞未全部消化就終止消化，細胞會(huì )貼在皿底很難吹打下來(lái)，可以再加入胰酶重新消化。

2、細胞傳代時(shí)的注意事項

（1）首先可以在A(yíng)TCC上查找細胞的傳代比例，然后根據細胞培養的狀態(tài)判斷傳代的合適比例。若細胞傳代過(guò)稀則可能會(huì )導致細胞不能擴增，若過(guò)密則影響細胞生長(cháng)狀態(tài)。

（2）細胞傳代天數的控制也很重要。若長(cháng)時(shí)間不傳代，細胞培養基顏色變黃，則證明培養基中的pH發(fā)生變化，會(huì )影響細胞狀態(tài)。

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