流式細胞技術(shù)（Flow Cytometry,簡(jiǎn)稱(chēng)FCM）是一種高效的方法，用于分析和收集細胞懸液中的單個(gè)細胞。FCM的優(yōu)勢在于其速度快、結果客觀(guān)，并且具有重要的統計意義。它能夠處理復雜的樣本，同時(shí)收集多個(gè)參數，其可靠性和重復性都非常出色。

今天我將總結并分享一系列關(guān)于流式細胞技術(shù)的常見(jiàn)問(wèn)題及其分析。對于流式細胞術(shù)的原理和步驟不甚清晰的同學(xué)，建議先閱讀本公眾號以往的文章，了解背景知識。

1.熒光抗體染色無(wú)信號或信號弱

（1）加入的抗體量不足：這是普通的一種情況，只需要摸索實(shí)驗條件，適當增加抗體的量或濃度。

（2）細胞數量過(guò)多：熒光弱可能是因為細胞相對于染料太多了，應該正確地調整細胞的密度，一般低于1*10^7個(gè)/ml。

（3）抗體儲存方式不對：抗體沒(méi)有保存在4℃并且避光，比如冷凍（-20℃甚至更低）保存可能會(huì )導致熒光抗體的沉降，顯著(zhù)影響抗體染色效果。

（4）用于細胞內染色的熒光染料分子量太大：染料體積太大，因此其進(jìn)入細胞的可能性降低。

（5）一抗和二抗不相容：使用的二抗應與一抗的物種來(lái)源相同（例如，一抗為兔源，則應該使用抗兔源二抗）。

（6）儀器問(wèn)題：（流式細胞儀的光學(xué)系統由三個(gè)部分組成：激光器、濾光片和檢測器。激光器的數量、檢測器的數量以及濾光器的類(lèi)型共同決定儀器的檢測范圍）。這三部分之一出現問(wèn)題的時(shí)候，就無(wú)法檢測到熒光信號。

如濾光片選擇有誤：不同熒光有不同的發(fā)射譜，為了檢測到信號，需要搭配能夠捕捉到該波長(cháng)信號的濾光片（濾光片可以將熒光激發(fā)后產(chǎn)生的相應波長(cháng)的光子引導至特定的傳感器上）；激光器沒(méi)有對齊：必要時(shí)通過(guò)運行液流檢查微珠來(lái)調整路線(xiàn)。

（7）靶蛋白不存在/表達水平低：巧婦難為無(wú)米之炊，要給靶蛋白染色，至少要確保組織/細胞類(lèi)型表達的靶蛋白至少處于足夠檢測的量。

（8）靶蛋白存在于細胞表面還是細胞內：有些抗原表達在細胞表面，有些表達在胞漿、細胞器內、胞核，甚至有些在所有部位都表達。比如對細胞系進(jìn)行染色時(shí)，胰蛋白酶通?？梢砸鸺毎砻娴鞍椎膬然?，因此需要確定好抗原的表達位置，選擇合適的染色方法。

（9）靶蛋白的表達需要經(jīng)過(guò)誘導：有些抗原在活化后發(fā)生下調，而有些蛋白則需要被誘導才能表達。因此要選擇合適的方法激活細胞，使其充分表達靶蛋白，同時(shí)要加蛋白轉運抑制劑使其留在胞內，然后固定破膜，染相應抗體。

（10）靶蛋白是分泌蛋白：分泌蛋白的檢測十分困難，因為蛋白會(huì )在檢測前從細胞中釋放出來(lái)且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細胞內染色法檢測靶標蛋白。

（11）補償過(guò)高：使用陽(yáng)性對照再次正確設置流式細胞儀

2.熒光強度過(guò)高

（1）抗體濃度過(guò)高：這將會(huì )導致非常明顯的非特異性結合或者是特異性結合的高強度熒光。

（2）過(guò)多抗體被捕獲于細胞內：在胞內染色的時(shí)候，較大的熒光分子被困在細胞內部。

（3）封閉不足：封閉這個(gè)操作可以有效地減少染料和蛋白的非特異性結合。

3.在應該只有一個(gè)細胞群的情況下觀(guān)察到多個(gè)細胞群

（1）樣品本身含有多個(gè)表達靶蛋白的細胞群：有可能是因為表達該靶蛋白的細胞群不止一個(gè)，但操作過(guò)程中沒(méi)有做好分離。

（2）出現細胞雙峰：出現了第一群兩倍熒光強度的第二群細胞?？赡苁羌毎蛛x不充分甚至是細胞團塊沒(méi)有過(guò)濾掉，導致檢測時(shí)多個(gè)細胞聚集在一起。

4.儀器檢測到的粒子太少

(這里的粒子指的是上樣時(shí)儀器檢測到的微粒，有可能是細胞，也有可能是破碎細胞產(chǎn)生的細胞器，或者沒(méi)有充分分離而形成的細胞團塊）

（1）細胞密度低：即每毫升樣品的細胞數目太少，自然檢測的效率就不高。

（2）檢測的參數當中電壓設置得太低。

（3）細胞聚集，堵塞管道：多個(gè)細胞聚集成團快，卻被檢測成一個(gè)粒子，且該粒子大小是異常的，在后續圈門(mén)也有可能被廢棄。染色前要輕輕吹打幾次，確保形成單細胞懸液，上樣之前最好再次混勻。另外，染細胞死活對于這一問(wèn)題也有幫助，因為死細胞會(huì )釋放它的DNA，而DNA非常粘稠，最后會(huì )導致細胞成團。

5.背景高或陽(yáng)性細胞百分比高

（1）抗體過(guò)量。

（2）補償過(guò)低：流式細胞分析中經(jīng)常要用到2種以上的熒光標記抗體進(jìn)行染色，而目前所使用的多種熒光染料發(fā)射譜間有一定重疊，也就是說(shuō)，熒光A的激發(fā)光會(huì )有一部分被熒光B的通道檢測到，這就是熒光溢漏。例如，當我們在進(jìn)行單色流式實(shí)驗的時(shí)候，可以在其他通道砍到熒光信號，這些熒光信號就是溢漏出來(lái)的熒光，而糾正熒光溢漏的過(guò)程就是“補償"。補償太低，就無(wú)法正確地糾正這些溢漏的熒光信號，使背景變高。

6.側向散射（反映細胞的顆粒度）背景高

（1）細胞裂解過(guò)度：制備樣品時(shí)離心或振蕩過(guò)度，使細胞破碎產(chǎn)生細胞碎片。

（2）細菌污染：從其它微小顆粒和背景信號中區分細菌群落的方法是用熒光染料標記細菌，然后使用該熒光來(lái)識別目標群落。

（3）死細胞的處理：流式細胞術(shù)非常容易被死細胞干擾，因為死細胞比活細胞更容易攝取抗體和探針，導致明顯的非特異性染色。且死細胞的自發(fā)熒光往往特別強，這樣背景熒光變強，就無(wú)法觀(guān)察到一些靶蛋白的弱陽(yáng)性表達了。

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