CRISPR慢病毒轉染法是一種高效引入CRISPR基因編輯系統到目標細胞中的技術(shù)，旨在實(shí)現對基因的有針對性編輯或調控。

實(shí)驗步驟：

1.質(zhì)粒構建：構建好含有CRISPR-Cas9系統的質(zhì)粒，其中包括lentiCRISPR-sgRNA。該質(zhì)粒攜帶

sgRNA序列，可指導Cas9蛋白準確識別并切割目標。

2.慢病毒包裝質(zhì)粒：準備慢病毒包裝質(zhì)粒，其中包括pCMV-VSV-G（攜帶包膜蛋白）和pCMV-dR8.2 dvpr（攜帶包裝蛋白）。這兩者協(xié)同作用，使得慢病毒能夠高效地傳遞CRISPR-Cas9系統到目標細胞內。

3.細胞培養：使用適宜的培養基培養目標細胞，通常選擇293T細胞，以確保細胞處于最佳的生長(cháng)狀態(tài)。

4.轉染試劑準備：在進(jìn)行轉染前，將培養基更換為適用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉染的Opti-MEM減血清培養基。同時(shí)，準備轉染試劑，包括Lipofectamine 3000、助轉劑P3000以及含有CRISPR-Cas9系統的質(zhì)粒。

5.轉染操作：將質(zhì)?；旌衔锱c轉染試劑按照試劑盒的推薦比例進(jìn)行混合，隨后滴加到目標細胞上，此過(guò)程中，確?；旌衔锱c細胞充分接觸，有利于轉染效率的提高。

6.培養條件：將細胞置于37°C、5%CO2的培養箱中，培養一定的時(shí)間，通常在48小時(shí)內。

7.收獲：收集細胞上清液，通過(guò)離心去除細胞殘渣。

8.濾膜過(guò)濾：使用0.22 μm孔徑的聚醚砜濾膜過(guò)濾細胞上清液，以去除殘留的細胞碎片和其他雜質(zhì)。

9.慢病毒收獲：得到的慢病毒上清液即為經(jīng)過(guò)純化和感染活性驗證的慢病毒，可用于后續實(shí)驗中對目標細胞進(jìn)行感染（若病毒感染效率低，可使用試劑盒進(jìn)行濃縮病毒）。

10.慢病毒感染：將目的細胞接種于 6孔板中，待細胞貼壁后進(jìn)行慢病毒感染，感染后48H，加入適量濃度的篩選藥物puromycin（具體濃度通過(guò)藥物篩選實(shí)驗獲得），24h后換液去除死細胞，繼續傳代維持培養。

11.單克隆篩選：

①流式細胞術(shù)篩選：此法存在一些不足之處，其中包括重懸細胞后進(jìn)行流式篩選的過(guò)程。因為這種操作可能導致細胞經(jīng)歷多次振蕩，增加了細胞的脆弱性，細胞的生存狀況可能會(huì )受到不良影響，所以不太建議采用這種方式。

②無(wú)限稀釋法，將96個(gè)細胞稀釋至10ml培養基中，然后將其種植到96孔板中，確保每個(gè)孔內只有一個(gè)細胞。完成種植后，建議在觀(guān)察過(guò)程中每次僅觀(guān)察十個(gè)孔，因為長(cháng)時(shí)間的外部觀(guān)察可能導致細胞受到應激損傷，影響后續的細胞培養，甚至會(huì )導致部分細胞死亡。進(jìn)行單克隆細胞培養時(shí)，首先將細胞鋪在96孔板中，培養至細胞長(cháng)至80%的融合后進(jìn)行消化。隨后，將細胞傳到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中，以確保單克隆的純化。并非所有細胞都能成功生長(cháng)，因此在考慮實(shí)際情況時(shí)，一般需要大約一兩個(gè)月的時(shí)間才能獲得理想的實(shí)驗結果。

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