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    免疫細胞轉染時(shí)相關(guān)事項要了解!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-10-06  點(diǎn)擊次數: 1025次
       常規免疫細胞轉染技術(shù)可分為兩大類(lèi):一類(lèi)是瞬時(shí)轉染,一類(lèi)是穩定轉染。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細胞中可存在多個(gè)拷貝數,產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動(dòng)子和其它調控元件的分析。一般來(lái)說(shuō),超螺旋質(zhì)粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72小時(shí)內分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測;后者也稱(chēng)穩定轉染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線(xiàn)性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉染細胞能整合,通常需要通過(guò)一些選擇性標記,如來(lái)氨丙基轉移酶(APH),潮霉素B磷酸轉移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反復篩選,得到穩定轉染的同源細胞系。
      免疫細胞轉染時(shí)的相關(guān)事項:
      1.細胞密度
      一般來(lái)說(shuō),當細胞密度達到60%-80%時(shí)進(jìn)行轉染可以取得較高的轉染效率,過(guò)低或過(guò)高都會(huì )影響轉染效果。
      2.細胞狀態(tài)
      這點(diǎn)非常關(guān)鍵,很多時(shí)候傳代次數太少或者太多都將導致細胞對轉染試劑敏感度的改變。因此,為了提高轉染效率以及轉染穩定性、降低細胞毒性,應盡量使用適度傳代的細胞系,并在不同次實(shí)驗時(shí)保持細胞傳代次數的一致性。盡量選擇無(wú)支原體污染的細胞,支原體污染是肉眼看不到的,可用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測,確保無(wú)支原體污染。
      3.細胞種類(lèi)
      不同細胞種類(lèi)的細胞在做轉染時(shí)所需要的轉染體系是不同的,不能一種體系用在所有類(lèi)型細胞的轉染實(shí)驗。
      4.DNA純度
      在制備高純度DNA時(shí),還需要對DNA進(jìn)行內毒素的去除,內毒素的存在會(huì )造成細胞毒性,嚴重影響轉染效率,現在市面上有很多去除內毒素的DNA純化試劑盒可供選擇。
      5.轉染試劑
      脂質(zhì)體試劑的毒性大,盡量選用脂質(zhì)體的轉染試劑。另外,在大規模使用前,需進(jìn)行轉染試劑和核酸優(yōu)比例的摸索。
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